Hakai는 m 6 A mRNA 메틸화 기계 의 핵심 구성 요소의 안정화에 필요합니다

Hakai는 m 6 A mRNA 메틸화 기계 의 핵심 구성 요소의 안정화에 필요합니다

N 6 -methyladenosine (m 6 A)는 mRNA의 대사 대부분 단계에 영향을 미치는 여러 생물학적 기능에 관여하는 mRNA의 가장 풍부한에 내부 변형이다.

 

E3 ubiquitin ligase Hakai는 이전 에 식물과 포유류 세포에서 m 6 A 메틸화 기계 의 구성 요소와 복합체에서 발견 되었지만 정확한 기능은 아직 조사되지 않았습니다. 여기에서 우리는 Hakai가 초파리 와 인간 세포 에서 메틸트랜스퍼라제 복합체의 보존된 구성요소임을 보여줍니다 . 에서는 초파리 에서의 공핍 결과 m 감소 6 수준 및 변경된 m 6성 결정을 포함한 A 의존적 기능. 우리는 그것의 유비퀴틴화 도메인이 이량체화 및 m 6 A 기계 의 다른 구성원과의 상호 작용에 필요 하지만 촉매 활성은 필요하지 않음을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 Hakai의 손실이 메틸트랜스퍼라제 복합체의 여러 소단위를 불안정화시켜 m 6 A 침착 을 손상시킨다는 것을 보여줍니다 . 우리의 연구는 m 6 A mRNA 작가 복합체 의 메커니즘에 대한 기능적 및 분자적 통찰력을 추가합니다 .

 

소개

N 6 -methyladenosine(m 6 A)은 진핵생물 1 , 2 , 3 , 4 에서 가장 풍부하고 잘 연구된 mRNA 변형 중 하나입니다 . 이 변형은 mRNA 대사의 거의 모든 측면에서 중심적인 역할을 하며 세포 분화 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , DNA 복구 9 , 일주기 리듬 10 , 11 과 같은 여러 생물학적 과정에 필수적입니다. , 12 , 신경발생 13및 성 결정 14 , 15 , 16 등을 포함합니다. 인간의 조절 장애는 대사 변화 17 , 신경 장애 18 , 19 및 다양한 유형의 암 20 , 21 , 22를 포함한 수많은 질병과 관련이 있습니다 . m 6 A 의 다운스트림 효과 는 일반적으로 m 6 A 변형 RNA에 우선적으로 결합 하고 운명 3에 영향을 미치는 "m 6 A 판독기" 로 알려진 YTH 도메인 RNA 결합 단백질에 의해 매개됩니다 .

 

mRNA 상의 m 6 A는 2개의 안정한 하위 복합체로 나눌 수 있는 보존된 다중단백질 복합체에 의해 동시 전사적으로 침착된다: 촉매 활성을 포함하는 m 6 A-METTL 복합체(MAC) 로도 알려진 이종이량체 METTL3/METTL14 , 및 전체 MAC 활동에 필요하고 WTAP(Fl(2)d), VIRMA(Virilizer), RBM15/RMB15B(Spenito) 및 ZC3H13(Flacc)을 포함 하는 m 6 A-METTL Associated Complex(MACOM) 23 , 24 , 25 . 보다 최근에 HAKAI라는 또 다른 인자가 식물 및 인간 세포에서 MACOM의 구성요소와 관련되어 있으며 m 6 A 수준 을 유지하는 데 필요하다는 것이 발견되었습니다 26 , 27 .

 

MAC 및 MACOM 구성 요소의 정확한 기능은 지난 몇 년 동안 집중적인 연구의 주제였습니다. 구조 연구는 METTL3과 METTL14가 안정한 이종이량체 28 , 29 , 30 을 형성하고 METTL14가 메틸 그룹 공여체 S-Adenosylmethionine에 결합할 수 없기 때문에 METTL3이 촉매 활성을 포함하는 유일한 인자임을 밝혀냈습니다. 그럼에도 불구하고 METTL14는 복합체의 RNA 표적과의 상호작용을 지원하고 METTL3 활성을 향상시키는 데 필수적입니다. WTAP는 METTL3과 METTL14 사이의 상호작용을 안정화하고 METTL3/METTL14 이종이량체를 핵 반점으로 모집하는 것으로 나타났습니다 15 , 31. RBM15/RBM15B는 mRNA의 U-풍부한 서열을 인식하는 RNA 결합 단백질이며 이러한 부위 32 에 매우 근접한 m 6 A 기계 를 모집하는 것이 좋습니다 . 또한 VIRMA은 선택적 m 용이하게하는 것이 제안되었다 (6) 종결 코돈 근처에 설치 및 폴리아 데 닐화 절단과의 상호 작용을 통해의 mRNA의 3 'UTR에 CPSF5 및 CPSF6 인자 27 . 마지막으로 4개의 최근 연구에서 ZC3H13이 MACOM 24 , 27 , 33 , 34의 일부로 확인되었습니다.. ZC3H13은 파리뿐만 아니라 마우스 배아 줄기 세포에서 WTAP와 RBM15 사이의 상호 작용을 안정화하고 핵에 작가 복합체의 국소화에 기여하는 것으로 밝혀졌습니다. 기능이 아직 제대로 탐색되지 않은 유일한 m 6 작가 구성 요소는 HAKAI입니다.

 

CBLL1이라고도 하는 HAKAI는 유비퀴틴화 및 E-cadherin 복합체의 후속 엔도사이토시스를 매개하여 세포-세포 접착 손실 및 증가된 세포 운동성 35을 유발하는 RING-핑거 유형 E3 유비퀴틴 리가제입니다 . HAKAI는 또한 RNA 표적 36의 일부를 결합하는 PTB 관련 스플라이싱 인자의 능력에 영향을 미침으로써 E-cadherin 독립적인 방식으로 세포 증식을 조절할 수 있습니다 . 지난 수십 년 동안 HAKAI는 상피-중간엽 전이 및 암 진행 37 의 맥락에서 주로 연구되었습니다 . 그러나 앞서 언급한 것처럼 HAKAI도 m 6 의 구성 요소라는 것이 점점 더 분명해졌습니다.척추동물과 식물의 생물발생 기계. HAKAI는 포유류 세포에서 가장 강력한 WTAP 상호작용자 중 하나로 38 그리고 WTAP, VIRMA 및 ZC3H13 39를 포함하는 진화적으로 보존된 단백질 복합체의 일부로 확인되었습니다 . 또한, Arabidopsis thaliana의 Hakai 돌연변이는 감소된 m 6 A 수준 26 과 함께 가벼운 발달 결함을 표시했습니다 . 최근에 우리는 Drosophila S2R+ 세포 의 Spenito(Nito) 상호작용체에서 가장 풍부한 단백질 중 Hakai를 확인 하여 m 6 A 경로 24 내에서 진화적으로 보존된 역할을 제안합니다 .

 

여기에서 우리는 Hakai가 MACOM의 보존된 구성원이며 파리에서 m 6 A 증착에 필수적임을 보고합니다 . m 6 A 경로 에서의 역할에 따라 Hakai는 성 결정 경로에서 기능하고 Sex lethal의 스플라이싱을 중재합니다.. 또한, 그것의 고갈은 다른 MACOM 구성 요소의 손실과 유사한 유전자 발현 및 스플라이싱 변경을 변경합니다. 우리는 파리의 Hakai가 뚜렷한 세포내 국소화를 나타내는 짧고 긴 단백질 이소폼을 인코딩한다는 것을 발견했습니다. 그것의 유비퀴틴 리가제 도메인은 동종이량체화 및 다른 MACOM 구성요소와의 상호작용에 필요합니다. 마지막으로, 우리는 Hakai 제거가 Virilizer(Vir), Fl(2)d 및 Flacc 단백질 수준의 심각한 감소로 이어진다는 것을 보여주며, 이는 Hakai가 MACOM 구성 요소의 안정성을 유지하는 데 필수적임을 나타냅니다.

 

결과

Drosophila Hakai는 보존된 MACOM 소단위입니다.

우리는 이전에 Drosophila S2R+ 및 마우스 ES 세포에서 각각 Nito 및 RBM15 상호작용체의 고농축 단백질 중에서 Hakai를 발견했는데 , 이는 이것이 MACOM의 보존된 구성원임을 시사합니다(그림 1a ) 24 . 에서는 초파리 , Hakai는 스 플라이 싱을 통해 네 개의 단백질 이소 형을 생성 할 수있다 : 두 짧고 긴 두 이성체 의한 대체 3 '스플 라이스에 인트론 유지의 결과로서 두 번째 엑손의 길이의 C 말단 영역의 연장 상이 첫 번째 인트론의 사이트(그림 1b). 모든 단백질은 RING형 E3 유비퀴틴 리가제 도메인과 인접한 C2H2형 징크 핑거를 공유합니다. 이 영역은 고도로 보존되어 있으며 포유동물에서 Hakai 이량체화 및 소위 "Hakai phosphotyrosine-binding domain"(HYB 도메인)의 형성에 필요한 것으로 나타났습니다(보충 그림 1 ) 40 . RNA isoform의 발현은 실시간 정량적 PCR에 의해 개발 중에 모니터링되었습니다(보충 그림 2 ). 짧은 동형과 긴 ​​동형 모두 m 6 A 프로필 과 크게 중첩되어 초기 배아 발생 및 난소에서 높은 농축을 나타내며, 이는 m 6 A 메틸트랜스퍼라제 복합체 15 , 24 의 다른 소단위의 전사체 분포와 일치합니다.. 또한, 긴 isoform은 수컷에서 특히 높아져 정자 형성 동안 가능한 기능을 암시합니다. 흥미롭게도, 우리가 S2R+ 세포에서 그들의 세포내 위치를 조사했을 때 우리는 짧은 동형(302 aa)이 세포 주변부에서 강한 신호로 세포질에만 존재한다는 것을 발견했습니다. (그림 1c ). 유충 뇌에서 파생된 세포인 BG3 세포에서도 유사한 결과가 얻어졌습니다(보충 그림 3a ). 또한 긴 이소형은 타액선의 폴리텐 염색체에 있는 전사 부위에 동일 위치에 있습니다(보충 그림 3b ). 전체적으로 m 6 이후A는 동시 전사적으로 기탁되었으며, 이러한 결과는 긴 동형만이 m 6 A 생물 발생 과 관련이 있을 수 있음을 시사합니다 .

 

그림 1: Hakai는 MACOM 구성 요소와 상호 작용합니다.

그림1

a 척추동물 및 초파리 의 MAC 및 MACOM 구성 요소 이름을 나타내는 표 . b RING 도메인(분홍색), Zn-핑거(회색) 및 HYB 도메인(검정색)을 나타내는 Hakai 짧고 긴 단백질 동형체의 개략도. 녹색 도메인은 isoforms 311aa 및 473aa에 포함된 두 번째 엑손의 대체 영역을 나타냅니다. c S2R+ 세포에서 과발현된 Myc-tagged Hakai 짧고 긴 단백질 이소폼의 면역염색. GFP 태그가 붙은 Barentsz 단백질은 세포질 마커로 사용되었습니다. DAPI 염색은 파란색으로 표시됩니다. 짧은 Hakai isoform은 세포질에 엄격하게 국한되는 반면, 긴 isoform은 핵이 풍부한 두 세포 구획에 국한됩니다. 스케일 바, 10μm. NS정량적 MS 기반 proteomics에 의해 분석된 2개의 복제 실험의 무표지 분석을 기반으로 S2R+ 세포에서 GFP-Hakai-long과 상호작용하는 단백질의 식별. HAKAI는 모든 MACOM 구성 요소와 함께 면역 침전합니다. MACOM 구성 요소 단백질은 빨간색으로 강조 표시됩니다. 정량화된 단백질의 전체 목록은 보충 데이터 2 에서 찾을 수 있습니다 . 전자 , 에프공동 면역 침전 실험은 Myc 태그 Hakai(긴 isoform) 및 HA 태그 Nito 또는 Fl(2)d로 형질감염된 S2R+ 세포에서 제조된 용해물로 수행되었습니다. 대조 레인에서, S2R+ 세포는 Myc 단독 및 동일한 HA 함유 단백질로 형질감염되었다. 추출물을 항-Myc 항체로 면역침전시키고 항-Myc 및 항-HA 항체를 사용하여 면역블롯팅하였다. 입력의 2%가 로드되었습니다. RNase T1이 있는 상태에서 동일한 실험을 반복했습니다. Nito 및 Fl(2)d는 RNase 독립적인 방식으로 Hakai와 상호 작용합니다. 표시된 오점은 하나의 생물학적 복제를 나타냅니다. GNito 및 Fl(2)d와의 Hakai 상호 작용을 조사하기 위한 효모 2종 하이브리드 분석. 단백질을 효모 발현 벡터에 클로닝하고 Gal4-DNA 결합 도메인(BD) 또는 Gal4-DNA 활성화 도메인(AD)과 융합시켰다. 표시된 벡터 조합은 효모에서 공동 발현되었고 활성화 또는 결합 도메인만 인코딩하는 빈 벡터가 대조군(Ctr)으로 사용되었습니다. 회수된 콜로니는 류신 및 트립토판이 결핍된 플레이트(-Leu, -Trp) 뿐만 아니라 아미노산 류신, 트립토판 및 히스티딘(-Leu, -Trp, -His)이 결여된 선택 플레이트에서 발견되었습니다. AD-Hakai 긴 isoform은 BD-Fl(2)d 및 BD-Nito와 상호 작용합니다. 웨스턴 블롯 및 효모-2-하이브리드 분석에 대한 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

 

전체 크기 이미지

Hakai가 Drosophila의 MACOM 구성 요소와 실제로 상호 작용하는지 확인하기 위해 Myc-GFP 태그가 지정된 발현 벡터에서 긴(473개 잔기) 이소폼을 인코딩하는 Hakai cDNA를 클로닝하고 Drosophila S2R+ 세포 에서 구조를 형질감염시켜 Myc 풀다운 분석을 수행한 다음 질량 분석기 분석. 우리는 Nito와의 상호 작용이 컷오프 바로 아래에 있었음에도 불구하고 태그가 지정된 Hakai가 모든 MACOM 구성 요소를 면역 침전시킬 수 있음을 발견했습니다(그림 1d , 보충 데이터 1 ). 또한, Mettl3 및 Mettl14는 침전된 단백질에 없었으며, 이는 MAC과 MACOM 사이의 상호작용이 약하거나 일시적이라는 우리의 이전 발견을 확인시켜줍니다.

 

이러한 결과를 확인하기 위해 우리는 S2R+ 세포에서 공동 면역 침전 분석을 수행했습니다. 우리는 Hakai가 RNA의 존재에 관계없이 다른 MACOM 구성 요소와 상호 작용할 수 있음을 발견했습니다(그림 1e, f ). Hakai와 Fl(2)d/Nito 사이의 상호작용에 대한 추가 확인은 효모-2-하이브리드(Y2H) 분석을 통해 얻어졌습니다(그림 1g ). 그러나 Hakai와 Flacc 사이의 상호 작용은 이 분석에서 감지되지 않았으며 Vir은 효모에서 성공적으로 발현되지 못했습니다. 아마도 크기가 크기 때문일 것입니다. 또한, 인간 HAKAI 구조 40 과 일치하여 Hakai 파리 오르토로그뿐만 아니라 이전에 보고되지 않은 Fl(2)d 및 Nito가 동종이량체화될 수 있음을 관찰했습니다(보충 그림 4a, b ).

 

우리의 데이터를 통틀어 Hakai는 파리 의 m 6 A 기계의 구성 요소이며 MACOM 구성 요소와 상호 작용하며 이 복합체 내의 여러 하위 단위가 하나 이상의 사본에 존재할 가능성이 있음을 나타냅니다.

 

Vir은 MACOM 구성 요소 상호 작용을 위한 스캐폴드 역할을 합니다.

MACOM 내에서 Hakai에 대한 더 나은 기계론적 통찰력을 얻기 위해 복합체의 다양한 구성 요소 간의 분자간 상호 작용을 정확하게 매핑했습니다. 이를 위해 우리는 전체 길이와 MACOM 서브유닛의 단편을 사용하여 RNase A의 존재 하에서 공동 면역침전 실험을 수행했습니다(그림 2a ). 이 실험의 결과는 Hakai N-말단 영역(잔기 1-295, 두 동형 모두에 공통)이 Vir의 N-말단 영역(잔기 1-130)과 상호 작용하는 반면(그림 2b, c ), 중간 영역 및 Fl(2)d의 C-말단(잔기 125-536)은 Vir C-말단(잔기 1501-1854)에 결합합니다(그림 2d, e ). F1(2)d의 동일한 영역은 동종이량체화에도 필요했습니다(보충 그림 4a). 이러한 데이터는 Vir이 Fl(2)d와 Hakai 사이의 상호 작용을 중재할 수 있음을 시사합니다. 이 가능성을 해결하기 위해 Hakai와 Fl(2)d가 Vir이 없는 경우에도 여전히 상호 작용하는지 테스트했습니다. 공동 면역 침전 분석은 vir KD 에서 상호 작용이 강하게 손상되었음을 보여주었습니다 (그림 2f 및 보충 그림 5a ). 유사하게, Hakai와 Nito 사이의 상호 작용은 극적으로 감소했습니다(보충 그림 5a, b ). 대조적으로, Hakai의 부족은 Fl(2)d와 Nito 또는 Vir의 결합을 방해하지 않았습니다(보충 그림 5c-e ). 따라서 이러한 결과는 Vir이 Fl(2)d, Hakai 및 Nito 사이의 상호 작용을 안정화할 가능성이 있음을 시사합니다(그림 2g ).

 

그림 2: Virilizer는 Hakai와 Fl(2)d 사이의 스캐폴드 역할을 합니다.

그림2

a Drosophila 공동 면역 침전 분석에 사용되는 단백질 및 단백질 단편 의 도식적 표현 . b – e 공동 면역 침전 실험은 Myc-GFP 태그 Virilizer(전체 길이 또는 단편) 및 HA 태그 Hakai-long( b ), Myc-GFP 태그 Hakai-long( 전체 길이 또는 단편) 및 HA 태그 Virilizer( c ), Myc-GFP 태그 Virilizer(전체 길이 또는 단편) 및 HA 태그 Fl(2)d( d ), Myc-GFP 태그 Fl(2)d( 전체 길이 또는 단편) 및 HA 태그 Virilizer( e). 대조 레인에서, S2R+ 세포는 Myc-GFP 단독 및 동일한 HA 함유 단백질로 형질감염되었다. 추출물을 마그네틱 아가로스 GFP 결합 비드와 함께 배양하고 표시된 대로 항-Myc 및 항-HA 항체( b – e )를 사용하여 면역블롯팅했습니다 . 입력의 2%가 로드되었습니다. 실험은 RNase A의 존재 하에 수행되었습니다. 표시된 이미지는 두 개의 생물학적 복제를 나타냅니다. f 대조군( LacZ ) 또는 vir 시 Myc-GFP 태그 Hakai-long 및 HA 태그 Fl(2)d로 형질감염된 S2R+ 세포에서 제조된 용해물을 사용하여 공동 면역침전 실험을 수행했습니다.KD. 대조 레인에서, S2R+ 세포는 Myc-GFP 단독 및 동일한 HA 함유 단백질로 형질감염되었다. 추출물을 마그네틱 아가로스 GFP 결합 비드와 함께 배양하고 항-GFP 및 항-HA 항체를 사용하여 면역블롯팅하였다. 입력의 2%가 로드되었습니다. g , h 초파리 ( g ) 또는 HEK393T 세포( h ) 에서 공동 IP 실험에서 파생된 Hakai, Vir 및 Fl(2)d 간의 상호 작용 도메인을 나타내는 개략도 . 주황색 점선은 인간 WTAP와 VIRMA 사이의 두 번째 상호 작용 영역을 나타냅니다. 웨스턴 블롯에 대한 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

 

전체 크기 이미지

다음으로 이러한 상호 작용이 인간 MACOM에서 보존되는지 여부를 조사했습니다. 이를 위해 우리 는 HEK293T 세포에서 여러 인간 MACOM 서브 유닛 (보충 그림 6a )을 과발현하고 RNase A의 존재하에 공동 면역 침전 실험을 수행했습니다. 우리는 HAKAI와 VIRMA의 N 말단 도메인 (잔기 1 –130)은 초파리 (그림 2b, c )와 인간(보충 그림 6b, c ) 사이에 보존 됩니다. 우리는 이전에 결정된 구조 40에 존재하지 않는 잔기 87-105에 걸쳐있는 HAKAI 영역 이이 상호 작용에 중요 하다는 것을 추가로 보여주었습니다 (보충 그림 6c, 레인 11-12). 유사하게, F1(2)d 상동체 WTAP(잔기 1-249)의 예측된 구조화 영역은 VIRMA와 공동 면역 침전되었습니다(보충 그림 6d ). 인간 VIRMA의 경우, 우리는 두 개의 별개의 상호작용 도메인을 확인했습니다. 한편으로 VIRMA 는 초파리에 대해 표시된 것처럼 C-말단 도메인(잔기 1575-1812)(보충 그림 6e )을 통해 WTAP와 상호 작용 합니다. 우리는 또한 잔기 335-1130에 걸쳐 있는 단백질의 중앙 영역에서 두 번째 WTAP 상호 작용 부위를 확인했습니다(보충 그림 6e , 레인 14). 흥미롭게도, 양쪽에서 더 멀리 이 영역을 자르면 상호 작용이 폐지되었습니다(보충 그림 6e, 레인 15-16), WTAP 결합이 여러 상호 작용 부위를 포함하거나 절단이 VIRMA 단백질 접힘을 방해함을 시사합니다. 종합하면, 이러한 결과는 VIRMA가 HAKAI와 WTAP를 초파리 와 인간 모두에서 MACOM 복합체로 조립하기 위한 상호작용 플랫폼 역할을 한다는 것을 보여줍니다 (그림 2g, h ).

 

Hakai는 mRNA m 6 A 메틸화 및 Sex lethal(Sxl) 의 대체 접합에 필요합니다.

초파리 에서 m 6 A 의 핵심 역할은 치명적인 성 ( Sxl ) 의 대체 접합에서 나타났으며 , 여기서 여성 41의 자동 조절이 필요합니다 . 암컷에서 Sxl은 정지 코돈을 포함하는 대체 엑손의 양쪽에 결합하고 수컷에게만 포함된 이 엑손을 건너뛰기 위해 스플라이스 부위를 차단합니다. 또한, Sxl은 또한 단일 X 염색체로부터 전사를 이중으로 상향 조절하기 위해 남성에서만 발현되는 투여량 보상 인자 msl-2의 발현을 방지한다. m 6 A의 손실은 암컷의 성 분화를 방해하고 비정상적인 용량 보상으로 인해 여성의 치사율을 증가시킵니다 14 , 15 ,16 . 따라서 우리는 Hakai의 손실이mRNA m 6 A 메틸화에도 필요한지여부와 초파리 성 결정 및 용량 보상을방해하는지 궁금했습니다.

 

우리는 Hakai 유전자 42 에서 이전에 특성화된 부정확한 트랜스포존 절단 라인을 얻었다 . 이 Hakai 1 대립유전자는 N-말단과 RING- 핑거 도메인을 덮는 코딩 영역이 없고 기능 상실로 간주됩니다(그림 3a ). 또한 CRISPR/Cas9 접근 방식을 사용 하여 초기 잘린 제품(처음 57aa)을 인코딩하는 Hakai 를 생성 했습니다 . 우리가 교차 할 때 Hakai 한 두 결핍 대립 유전자 중 하나에 ( Df를 (2L) Exel8041 또는 Df를 (2L) Exel6044 ) 유전 적 배경 효과를 정상화하기 위해, 우리는 돌연변이가 번데기 단계 (사망 발견 n은  = 240). 그들을6 Hakai 1 /Df(2L)Exel8041 번데기 의 수준은 대조군 과 비교하여 감소 했지만 (그림 3b-d ), Mettl3 null 돌연변이체 14 에서처럼 완전히 없는 것은 아닙니다 .

 

그림 3: Hakai는 m 6 A 메틸화 및 성 -치사 대체 접합 을 조절하여 성 결정에 필요합니다 .

그림3

Hakai 1 대립형질 의 결실 과 Hakai 대립형질에 존재하는 조기 종결 코돈 을 생성하는 데 사용된 트랜스포존(검은색 삼각형)을 묘사 하는 Hakai 게놈 유전자좌 의 개략도 , 그리고 짧고 긴 동형체의 에피토프 태그가 지정된 UAS 구성. 표준 및 메틸화된 뉴클레오티드( b ) 를 나타내는 2D 박층 크로마토그래피(TLC) , 대조군( c ) 및 Hakai 1 /Df(2L) Exel8041 번데기( d ) 에서 m 6 A를 나타내는 TLC의 개략도 . e Sxl 7BO 와 교배된 표시된 유전자형의 교배에서 암컷 파리의 생존력수컷. Mettl3 또는 Hakai 의 한 카피의 손실은 Sxl 과 da 의 한 카피 가 없는 유전적 배경에서 여성의 생존을 상당히 감소시킵니다 . 생존력은 남성에 비해 여성의 수로부터 계산하였고, 통계적 유의성은 χ 2 test(Graphpad Prism) 로 결정 하였다. * * * P  ≤ 0.0001). 비동등 분산에 대한 쌍이 없는 양측 스튜던트 t 검정 . f Hakai /Df(2L)Exel8041의 생존 가능성 . g 동형접합 vir 2F를 사용한 암컷 파리의 생존력돌연변이는 Hakai 의 단일 사본의 손실에 의해 구출될 수 있습니다 . 생존력은 동형접합 vir 2F 암컷의 수와 이형평형체를 가진 남매 의 수로부터 계산 하였고, 통계적 유의성은 χ 2 test(Graphpad Prism) 로 결정 하였다. * * * P  ≤ 0.0001). h – n 외부 성적 분화( h , j – n ) 및 Sxl 대체 접합 복부 및 두부/흉부 분획( i ) 대조군, vir 2F /vir ts 및Hakai 1 vir 2F /vir ts 암컷 파리. ( i )에 표시된 젤 은 두 가지 생물학적 복제를 나타냅니다. 마커는 상단에 500bp가 표시된 100bp DNA 사다리입니다. 참고 SXL 대안적인 스 플라이 싱 Hakai 1 비르 2F / 비르 TS 암 복강 수형 모드로 전환되고, 이들 여성이 남성 색소 (표시한다는 H , m을 )되지만 남성 성 빗 ( H ). TLC, 플라이 수 및 RT-PCR 젤에 대한 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

 

전체 크기 이미지

Hakai가 필요한지 여부를 테스트하려면 SXL의 자동 조절, 우리는 복사본 하나를 제거하여 감소 SXL의 수준에 따라 유 전적으로 민감 배경으로 사용했다 daughterless ( 다 에 관여), SXL의 전사, 그리고 하나 개의 사본 SXL이 필요 SXL의 자동 조절 . da Df /+ 사이의 교배 자손에서 ; Mettl3의 널 / + 암컷 SXL 7B0의 널 수컷은 대부분의 여성 (도. 사망 의 3e ). 마찬가지로, Hakai 의 한 사본도 제거하여 암컷을 죽였습니다(그림 3e ).

 

또한, 초기 정지 코돈이 있는 Hakai /CyO 암컷을 Df(2L)Exel8041/CyO 수컷과 교배 하여 유전적 배경을 정상화했을 때 CyO 밸런서 를 보유한 대조군 동물(암컷 149마리 및 수컷 144마리)에 비해 암컷 치사율이 강함을 관찰했습니다. , 도 3f ). Mettl3 null 및 Mettl14 null 돌연변이 14 , 15 , 16에서  관찰된 바와 같이 우리가 얻은 두 마리의 암컷은 성전환을 나타내지 않았지만 모든 수컷 파리는 날지 못했습니다( n = 44) .

 

Sxl 대체 스플라이싱 에서 Hakai의 관련성을 추가로 확인하기 위해 우리는 여성-치사 vir 2F 대립유전자 14를 사용했습니다 . 우리의 사본의 제거 발견 Hakai는 암 생존 복원 비르 2F / Df를 (2R) BSC778 보정하여 암컷 SXL 스 플라이 싱 (도. 3g을 복잡 메틸화 된 다른 구성 요소에 이전에 도시 한 바와 같이) 14 , 24 .

 

마지막으로, 초파리 암컷 의 성적 분화에서 Hakai의 역할을 입증하기 위해 vir 2F /vir ts 유전적으로 감작된 배경을 사용했는데, 이 배경은 때때로 이 암컷의 복부 부분 5와 6에 짙은 색소 남성 조직의 패치를 보여줍니다(그림 1a). 3j–l ). 놀랍게도, Hakai 의 한 사본을 제거 하면 대다수의 암컷에서 수컷 색소 침착이 발생하고(그림 3h, m ) , 그렇지 않으면 건너뛴 수컷 엑손을 포함하여 Sxl 대체 스플라이싱이 수컷 모드로 전환됩니다(그림 3i , 레인 5). 일부 암컷은 또한 성기의 성간 발달을 보였다(그림 3n). 흥미롭게도, vir 2F /vir ts 유전적으로 감작된 배경 에서 Hakai의 손실은 Sxl 조절의 조직 특이성을 드러냈습니다. 암컷의 앞부분(머리와 흉부)의 대체 스플라이싱이 변경되지 않았으며, 이 암컷도 수컷 섹스 빗을 표시하지 않았기 때문입니다. (그림 3h ), m 6 A 경로의 주요 기능은 서로 다른 조직에 걸쳐 강력한 Sxl 대체 스플라이싱 을 보장하는 것일 수 있음을 시사합니다 .

 

Hakai 는 초파리 의 m 6 A 경로를 조절합니다

Hakai 가 Drosophila 의 진정한 m 6 A 작가 임을 더욱 확증하기 위해 우리는 S2R+ 세포에서 Hakai의 생성물을 고갈시키고 그 효과를 다른 m 6 A 경로 구성 요소 의 KD와 비교했습니다 . Hakai가 m 6 A 작가 복합체 의 일부라는 것과 일치 하게, 그것의 손실은 질량 분석법에 의해 측정된 mRNA 에서 m 6 A 수준 의 상당한 감소로 이어졌습니다 (그림 4a ). 그러나, 이러한 감소 (32 %)로서 m로 발음되지 6 에서 TLC에 의해 얻어진 결과와 일치되는 Mettl3 / Mettl14 이질 (59 %)의 고갈에 따라 관찰 환원 Hakai 1 / Df를 돌연변이 번데기 (도 . 3C, D). 우리는 다음으로 m 6 A 의존적 스플라이싱 이벤트 의 조절에 대한 관련성을 조사했습니다 . 우리는 이전에 개별 m 6 A 작가 15 , 24의 KD에 대한 여러 전사체의 접합 패턴 변화를 보고했습니다 . 영향을 받는 두 전사체, fl(2)d 및 Hairless 의 RT-qPCR에 의한 스플라이싱 이소형 정량 은 S2R+ 세포 에서 Hakai KD 및 Mettl3/Mettl14 KD에서 유사한 이소형 이동을 초래했습니다 (그림 4b ). 전사체 전체 수준에서 Hakai의 고갈결과적으로 m 6 A 기계 의 다른 구성 요소의 KD에서 발생하는 변화와 실질적으로 겹치는 유전자 발현 및 스플라이싱의 변화가 발생했습니다 (그림 4c , 보충 그림 7 ). 특히 Hakai KD는 개별 MACOM 구성 요소 고갈에 대한 이전 연구 결과와 일치하여 대체 5' 스플라이스 사이트 사용 및 인트론 보유를 모두 증가 시켰 습니다(그림 4d 24 ). MAC 구성 요소의 고갈은 MAC 구성 요소의 손실에 비해 유전자 발현 및 스플라이싱에 더 강한 영향을 미칩니다. 이것은 Mettl3 및 Mettl14가 파리 생존에 필수 불가결한 반면 MACOM 서브유닛은 14 , 15 가 아님을 보여주는 이전 유전 데이터와 일치합니다., 16 , MACOM 구성 요소에 대한 추가 기능 지원. 종합하면, 이러한 결과는 Hakai가 MACOM의 진정한 구성 요소이며 m 6 A 생물 발생 및 기능에 필요하다는 것을 보여줍니다 .

 

그림 4: Hakai는 m 6 A 수준과 m 6 A 종속 접합 이벤트를 조절합니다.

그림4

a 대조군 샘플 또는 S2R+ 세포의 표시된 단백질이 고갈된 mRNA 추출물에서 m 6 A 수준 의 LC-MS/MS 정량화 . 막대 차트는 3개의 생물학적 복제 및 3개의 기술적 측정의 표준 오차(SE)가 있는 평균을 보여줍니다. Hakai의 KD는 m 6 A 수준 의 상당한 감소를 초래 합니다. * * * P  = 7.49E−04(Hakai KD), * * * * P  = 7.51E−06(Mettl3, Mettl14 KD). 비동등 분산에 대한 쌍이 없는 양측 스튜던트 t 검정 . b m 6 A 조절 유전자 의 상대적 동형 정량화 ( fl(2)d 및털이 없음 ) 표시된 구성 요소가 고갈되면. 막대 차트는 3개의 생물학적 복제 및 3개의 기술적 측정의 표준 오차(SE)가 있는 평균을 보여줍니다. m 6 A 종속 접합 규정에는 Hakai가 필요합니다 . c 표시된 단백질(왼쪽) 및 공통 차등 접합 대상(오른쪽)의 녹다운 시 차등 접합 이벤트 수(FDR < 0.1). d 레이더 차트는 Fl(2)d 및 Hakai의 녹다운 시 차등적으로 접합된 이벤트의 상대적 분포를 표시합니다. 대안 5' 스플라이스 부위(A5SS) 선택 및 인트론 보유(RI)는 m 6 A 기록기 구성요소 손실 시 과도하게 나타나는 이벤트 입니다. m 6에 대한 소스 데이터측정, qPCR 및 RNA-seq는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

 

전체 크기 이미지

Hakai 유비퀴틴화 도메인(MACOM 무결성 유지에 필요한 활동은 아님)

우리는 다음으로 MACOM 내에서 Hakai의 분자적 역할을 다루려고 했습니다. Hakai는 포유동물에서 잘 연구된 E3 유비퀴틴 리가제이기 때문에 유비퀴틴화 활성이 m 6 A 경로 내에서 어떤 역할을 하는지 궁금했습니다 . 이 가능성을 해결하기 위해 우리는 야생형 Hakai cDNA( Hakai WT ) 또는 유비퀴틴화 활성을 폐지해야 하는 RING 도메인( Hakai ΔRING ) 에 점 돌연변이를 포함하는 cDNA를 발현하는 구성을 생성했습니다 ("방법" 참조). 그런 다음 우리는 Hakai 돌연변이 파리 에서 구조 실험을 수행 했으며 야생형 형태는 치사율을 구출할 수 있었지만 돌연변이된 버전은 그렇게 하지 못한다는 것을 발견했습니다. 이것은 비행 생존에 RING 도메인이 필요함을 나타냅니다.

 

따라서 우리는 Hakai가 MACOM 구성 요소의 유비퀴틴화를 통해 m 6 A 수준을 조절할 수 있는지 궁금했습니다 . 이 가능성을 조사하기 위해 우리는 Drosophila S2 세포 의 이전 유비 퀴틸롬 데이터 세트를 조사하고 Fl(2)d와 Nito가 유비퀴틴화된 단백질 43 중 하나임을 발견했습니다 . 따라서 우리는 벡터를 포함하는 GFP 태그에서 두 단백질을 모두 복제하고 대조군에서 발현시켰고 Hakai는 유비퀴틴화를 모니터링하기 위해 S2R+ 세포를 고갈시켰습니다. 우리는 엄격한 8M 우레아 조건에서 두 단백질을 면역 침전시켰고 Nito에 대한 유비퀴틴화 신호를 감지할 수 없었지만, Fl(2)d는 분자량이 100kDa 이상으로 강하게 이동하는 것으로 나타났듯이 폴리유비퀴틴화되는 것으로 나타났습니다(보충 그림 4). 8a). 질량 분석 분석을 사용하여 Vir과의 동종이량체화 및 상호작용에 필요한 영역에 있는 Fl(2)d(보충 데이터 2 )에서 이전에 식별된 4개 사이트(K236 및 K245) 중 2개를 매핑할 수 있었습니다(그림 2e , 보충 그림 2). . 4A ). 우리는 Fl(2)d ubiquitination이 Hakai KD 조건 에서 감소 되었음을 알았습니다 . 그러나 면역 침전된 Fl(2)d의 전체 수준도 감소했습니다. 따라서 우리는 단백질 분해를 방지하기 위해 대조군 조건에서 프로테아좀 억제 후 이 실험을 반복했습니다. 이 실험은 우리의 이전 관찰을 확인시켜주었습니다. Fl(2)d는 유비퀴틴화되었고 단백질 강도는 Hakai 에서 크게 감소 했습니다.케이디. 그러나 프로 테아 좀 억제시 Fl(2)d의 수준과 유비퀴틴 화는 효율적인 Hakai 고갈 에도 불구하고 변하지 않은 채로 유지되었습니다 (보충 그림 8b ). 이것은 Hakai가 Fl(2)d 유비퀴틴화에 대한 책임이 없지만 안정성을 위해 필요함을 나타냅니다.

 

E3 유비퀴틴 리가아제로서의 Hakai의 기능에 대한 더 나은 통찰력을 얻고 다른 추정 대상을 찾기 위해 우리는 다음으로 Hakai KD 조건에 비해 대조군의 S2R+ 세포에서 유비퀴틸롬 분석을 수행했습니다 . 무거운 아미노산으로 동위원소로 표지된 세포 는 Hakai에 대해 고갈되었고 가벼운 아미노산으로 동위원소로 표지된 세포는 정방향 실험에서 대조군으로 사용되었습니다. 반대의 고갈도 반대 실험에서 수행되었습니다(보충 그림 8c ). 단백질은 엔도-프로테이나제 Lys-C로 분해되었고 펩티드는 LC-MS/MS를 통해 유비퀴틴화 부위를 식별하기 위해 디-글리신-리신 잔여물 인식 항체로 더욱 풍부해졌습니다. 우리는 3000개 이상의 유비퀴틴화 사이트를 찾았지만 예기치 않게 단일 사이트가Hakai 고갈 및 SesB의 단 하나의 사이트만 1.5배 증가했습니다(그림 5a , 보충 데이터 3 ). 따라서 이 실험은 Hakai가 Drosophila S2R+ 세포 에서 E3 ubiquitin ligase로 작용하지 않음을 시사합니다 . 또는 유비퀴틴화 활성이 특정 외부 자극에 의존하거나 분석의 제한된 깊이로 인해 Hakai에 의해 규제되는 유비퀴틴화 사이트를 정량화하지 않았을 수 있습니다.

 

그림 5: Hakai RING 도메인은 MACOM 구성 요소와의 상호 작용에 필요합니다.

그림 5

a S2R+ 세포에서 Hakai 의존성 유비퀴틴화 단백질 의 질량 분석 분석. log2 스케일에 플롯된 정규화된 정방향 대 역방향 실험의 산점도. 임계값은 이중 농축 또는 고갈로 설정되었습니다(빨간색 점선). 오른쪽 상단 사분면에 있는 하나의 단백질은 두 복제 모두에서 풍부합니다. Hakai 고갈은 D. melanogaster S2R+ 세포의 전반적인 유비퀴틴화 수준에 영향을 미치지 않습니다 . HAKAI 고갈 후 정량화된 유비퀴틸화 사이트의 전체 목록은 보충 데이터 3 에서 찾을 수 있습니다 . b – d Myc-GFP-tagged Hakai-long(WT 또는 RING 돌연변이체) 및 HA-tagged Hakai-long( b), HA 태그가 있는 Fl(2)d( c ) 및 HA 태그가 지정된 Virilizer 단편( d ). 대조 레인에서, S2R+ 세포는 Myc-GFP 단독 및 동일한 HA 함유 단백질로 형질감염되었다. 추출물을 자기 GFP 바인더 비드와 함께 배양하고 표시된 대로 항-Myc 및 항-HA 항체를 사용하여 면역블롯팅했습니다. 입력의 2%가 로드되었습니다. 실험은 RNase A의 존재 하에 수행되었습니다. 표시된 이미지는 두 개의 생물학적 복제를 나타냅니다. Western blot에 대한 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

 

전체 크기 이미지

우리는 Hakai RING 도메인의 중요성과 S2R+ 세포에서 얻은 데이터의 중요성을 나타내는 생체 내 결과 사이의 명백한 불일치를 설명할 수 있는 것이 무엇인지 궁금했습니다. 포유류의 이전 결정 구조는 HAKAI 이량체화에 RING 도메인이 필요함을 보여주었습니다 40. 한 가지 가능성은 우리가 RING 도메인에서 생성한 점 돌연변이가 Hakai의 이량체화 능력을 변경하고 아마도 다른 MACOM 구성 요소와 상호 작용할 수 있다는 것입니다. 이 아이디어를 테스트하기 위해 우리는 S2R+ 세포를 Myc-GFP 태그가 붙은 Hakai 야생형 또는 돌연변이 RING 도메인 및 Hakai 자체를 포함한 MACOM의 다른 구성요소로 공동 형질감염시켜 공동 면역침전 실험을 수행했습니다. WT Myc-GFP-Hakai가 HA-Hakai를 강력하게 면역침강시킨 반면, RING 돌연변이는 그렇게 하지 못했으며, 이는 포유류에서와 같이 RING 도메인이 Hakai 동종이량체화에 필요함을 나타냅니다(그림 5b ). 더 중요한 것은 Fl(2)d 및 Vir과의 상호 작용도 크게 손상되었다는 것입니다(그림 5c, d). 우리는 이 결과를 다른 MACOM 구성 요소와의 연관성을 위해 Hakai 이량체화가 필요할 가능성이 있다는 표시로 해석합니다.

 

MACOM 부품의 안정화를 위해 Hakai가 필요합니다.

지금까지 우리의 결과는 Hakai가 MACOM 구성 요소에 대한 유비퀴틴 활성을 가지고 있지 않으며 이러한 구성 요소의 조립을 허용하는 발판 역할도 하지 않는다는 것을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고 위에서 언급한 바와 같이 우리는 Hakai 고갈이 Fl(2)d 단백질 수준을 강하게 불안정화 한다는 것을 발견했습니다 . 또한 공동 면역 침전 실험에서 Fl(2)d 및 Vir에 대한 단백질 입력 수준이 Hakai KD 에서 일관되게 감소 되었음을 확인했습니다 (보충 그림 5c, d), Hakai가 이러한 소단위를 안정화하는 데 필요할 수 있음을 시사합니다. 이러한 이유로 우리는 비교 가능한 입력 수준과 해석 가능한 공동 면역 침전 데이터를 갖기 위해 이러한 구성 요소의 두 배를 형질 감염시켜야 했습니다. 이러한 관찰을 확인하기 위해 우리는 Hakai 고갈 후 S2R + 세포에서 전역 프로테옴 분석을 수행하여 편견 없는 접근 방식을 취했습니다 . 예상대로 Hakai 수준이 크게 감소하여 성공적인 KD를 나타냅니다(그림 6a ). 더 놀랍게도, 우리는 강력하게 하향 조절되는 7개의 추가 단백질을 확인했으며 그 중 3개의 MACOM 구성 요소: Fl(2)d, Flacc 및 Vir(보충 데이터 4). Vir에 대한 하향 조절 범위는 Hakai의 경우와 유사했으며, 이는 Hakai 손실이 Vir 안정성에 특히 강한 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 대조적으로, 우리는 Nito, Mettl3 및 Mettl14의 단백질 수준에서 실질적인 변화를 감지하지 못했습니다. 우리는 Fl(2)d 수준의 특정 감소를 웨스턴 블롯으로 확인할 수 있었습니다(그림 6b, c 및 보충 그림 9d ). 그러나 면역 형광 분석 결과 핵 위치에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다 (보충 그림 8d ).

 

그림 6: Hakai는 다른 MACOM 구성 요소의 안정성을 조절합니다.

그림 6

a S2R+ 세포에서 Hakai 의존성 프로테옴 의 질량 분석 분석. log2 스케일에 플롯된 정규화된 정방향 대 역방향 실험의 산점도. 임계값은 1.4배 농축 또는 고갈로 설정되었습니다(빨간색 점선). 왼쪽 하단 사분면의 단백질은 두 복제 모두에서 감소합니다. 전체 프로테옴 분석의 두 복제에서 수준이 >1.4배 감소한 단백질의 히트 맵. m 6 A 라이터 컴플렉스 및 리더 단백질 의 다른 구성요소는 비교를 위해 표시됩니다. 정량화된 단백질의 전체 목록은 보충 데이터 4 에서 찾을 수 있습니다 . NS대조군 세포와 Hakai에 대해 고갈된 세포의 내인성 Fl(2)d, Mettl3 및 Mettl14 단백질의 수준을 웨스턴 블롯으로 분석했습니다. 튜불린을 로딩 컨트롤로 사용했습니다. 아래 표시된 오점에서 Fl(2)d, Mettl3 및 Mettl14 수준의 정량화(왼쪽). 막대 차트는 4개의 생물학적 복제물의 표준 오차(SE)가 있는 평균을 보여줍니다. * * * P  = 2.48E−04(Hakai KD). 등분산에 대한 쌍이 없는 양측 스튜던트 t 검정 . Hakai 고갈은 Fl(2)d를 강하게 불안정하게 하지만 Mettl3 또는 Mettl14 단백질은 그렇지 않습니다. Hakai의 상대적 발현 수준은 KD 효율성의 검증으로 표시됩니다. 막대 차트는 세 가지 기술 측정의 표준 오차(SE)가 있는 평균을 보여줍니다(오른쪽 아래). c ,d Hakai , Mettl3 , nito ( c ) 또는 Hakai , vir , Flacc ( d ) 고갈 시 Fl(2)d 수준 분석 . 대조군 및 고갈된 세포의 단백질 용해물을 내인성 Fl(2)d 단백질 수준에 대해 웨스턴 블롯으로 분석했습니다. 튜불린을 로딩 컨트롤로 사용했습니다. 하나의 대표적인 실험이 표시되고 3개의 생물학적 복제물의 정량화가 아래에 나와 있습니다. 막대 차트는 표준 오차(SE)가 있는 평균을 보여줍니다. ( c ) * * * * P  = 4.74E−05(Hakai KD), ns P  = 0.80029(Mettl3 KD) 및ns P  = 0.05398(Nito KD). ( d ) * * P  = 0.0057(Hakai KD), P  = 0.0012(Vir KD)(Hakai KD), ns P  = 0.6061(Flacc KD). 등분산에 대한 쌍이 없는 양측 스튜던트 t 검정 . 이자형HAKAI 또는 VIRMA에 대해 스크램블된 siRNA 또는 siRNA로 형질감염된 HeLa 및 U2OS 세포에서 제조된 용해물을 사용하여 웨스턴 블롯을 수행했습니다. 표시된 항체를 사용하여 추출물을 면역블롯팅하였다. HAKAI의 고갈은 VIRMA 수준을 감소시켰지만 VIRMA의 고갈은 HAKAI 수준에 영향을 미치지 않았습니다. 표시된 이미지는 두 개의 생물학적 복제를 나타냅니다. 웨스턴 블롯에 대한 소스 데이터, 단백질 수준 측정 및 qPCR은 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

 

전체 크기 이미지

Fl(2)d 또는 Vir의 손실이 다른 m 6 A 작가 구성 요소 의 안정성에도 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 이러한 단백질이 고갈된 후 S2R+ 프로테옴 분석을 반복했습니다. 우리는 Fl(2)d 단백질 수준이 vir KD 에서 유의하게 감소 했으며 그 반대도 마찬가지 임을 발견했습니다 (보충 그림 9a-c ). 유사하게, Hakai 고갈에서 나타난 바와 같이 , Flacc 레벨도 감소했습니다. 그러나 두 경우 모두 Hakai와 Nito의 수준에는 영향을 미치지 않았습니다. 이것은 웨스턴 블롯으로도 확인되었습니다(그림 6d 및 보충 그림 9e ). 종합적으로, 이러한 결과는 Hakai가 3개의 MACOM 구성 요소를 안정화시키는 기능을 하며 이것이 m 6A 레벨이 고갈되면 감소합니다.

 

MACOM 구성 요소 안정화에서 Hakai의 역할은 인간에서 보존됩니다.

인간 이종상동체를 가진 Hakai의 높은 보존성과 Vir와의 상호작용을 감안할 때, 우리는 MACOM 내의 HAKAI 기능이 인간에서 보존되는지 궁금했습니다. 이를 위해 우리 는 HeLa 및 U2OS 세포에서 인간 HAKAI 및 VIRMA 를 고갈 시키고 단백질 수준을 모니터링했습니다. 우리는 VIRMA 의 손실이 HAKAI 수준에 영향을 미치지 않는다는 것을 관찰했으며 (그림 6e ), Drosophila homologues 에서도 볼 수 있습니다. 대조적으로, HAKAI의 고갈은 VIRMA 수준을 크게 감소시켰지만 Nito의 인간 오르토로그인 RBM15 수준은 감소시키지 않았습니다. 종합하면, 이러한 발견은 MACOM 내에서 HAKAI의 역할이 인간에서 보존되고 Hakai가 m 6 의 기능을 유지하는 데 필수 불가결함을 나타냅니다.MACOM 구성 요소의 안정성을 보장하는 라이터(그림 7 ).

 

도 7 :. 모델은 m의 조성을 나타내는 6 것은 플라이 인간 무결성 MACOM Hakai에의 영향에서 메틸화 된 복합체.

그림 7

상위 좌우 인간을 나타내고, m 날 (6) 을 각각하는 메틸화 된 복합체. (아래) Hakai의 고갈은 Vir, Flacc 및 Fl(2)d에 대한 단백질 수준의 감소로 이어집니다.

 

전체 크기 이미지

논의

우리는 최근 두 개의 보존된 하위 복합체, MAC 및 MACOM 이 파리와 마우스 24의 mRNA에 m 6 A 를 증착하기 위해 상호 작용한다는 것을 보여주었습니다 . 이종이량체 METTL3 및 METTL14로 구성된 촉매 MAC의 구조가 완전히 특성화되었지만 28 , 29 , 30 , MACOM에 대한 우리의 지식은 제한적입니다. 특히, 각 소단위체의 전체 구성, 조립 및 정확한 기능은 여전히 ​​불명확하다. 우리의 연구는 Hakai를 초파리 와 인간 세포 에서 MACOM의 필수 구성 요소로 식별 합니다. 이 기능에 따라 Hakai가 Vir 및 기타 MACOM 구성 요소와 상호 작용하고 그 소모가 m 6 감소함을 보여줍니다.다른 MACOM 서브유닛의 손실과 유사한 유전자 발현의 변화를 초래했습니다. 또한 Hakai 가 없는 파리 는 치명적이며 성 결정 및 투여량 보상 경로에서 MACOM의 역할과 일치하는 치명적인 Sex lethal 의 비정상적인 접합을 나타 냅니다. m 6 A 경로 의 다른 돌연변이에서 이전에 나타난 것처럼 치사율을 피하는 소수의 개체는 날지 못합니다 . 기계적으로, 우리는 Hakai가 여러 MACOM 구성 요소를 안정화하는 데 필요하다는 것을 발견했으며, 이는 m 6 A 증착에 대한 요구 사항을 설명하는 것으로 보입니다 .

 

발생하는 질문은 모든 MACOM 구성 요소가 이제 식별되었는지 여부입니다. 우리와 다른 사람들은 Fl(2)d, Vir, Flacc, Nito 및 Hakai를 포함한 5가지 요소를 검증했습니다(이 연구 및 14 , 15 , 16 , 24 , 33 ). 초기 생화학적 연구에서는 인간 메틸트랜스퍼라제 복합체 44 의 큰 형태에 대해 875kDa의 분자량을 추정했습니다 . 결합된 5가지 요인의 계산된 총 분자량은 600kDa에 해당하며, 이는 복합체에 추가 요인 또는 알려진 요인의 여러 사본이 포함되어 있음을 나타냅니다. 우리의 데이터는 Hakai, Fl(2)d 및 Nito가 자가 상호작용하는 능력이 있음을 보여줍니다(보충 그림 4). 이 세 가지 요소가 이량체로 존재한다고 가정하면 총 중량은 최대 868kDa에 도달하며 이는 MACOM의 예상 질량과 일치합니다. 그럼에도 불구하고 다른 복잡한 구성 요소의 정확한 정체성과 화학량론을 확인하려면 추가적인 생화학적 및 구조적 특성화가 필요합니다.

 

Hakai는 의심할 여지 없이 복합체의 핵심 구성요소이지만, 그것의 유전자 비활성화가 다른 MACOM 구성요소의 비활성화와 비교하여 더 가벼운 표현형을 초래한다는 것은 놀라운 일입니다. 실제로, Hakai 기능 상실 돌연변이체 에서 발달 치사율을 벗어난 소수의 암컷은 수컷 성 빗을 표시하지 않았으며 이 표현형은 Hakai 투여량이 감소된 감작된 배경에서도 관찰되지 않았습니다 . 그러나 암컷은 복부에 남성의 색소 침착을 나타내어 성에 대한 조직별 변화를 나타냅니다. 이러한 가벼운 결함은 Hakai 돌연변이 에서 m 6 A 수준 의 정량화와 일치합니다 (그림 3).), Mettl3 돌연변이체 14 에서 관찰된 바와 같이 감소된 것으로 보이지만 완전히 부재하지는 않습니다 . 또한, Sxl 접합은 이 인자에 대한 국부적 요구 사항을 나타내는 조직 특이적 변경을 보여주었습니다. 이러한 결과는 Hakai가 m 6 A 수준과 유기체 발달 26 에 미치는 영향이 덜 뚜렷함을 보여주는 Arabidopsis 의 이전 연구와 일치 합니다. 이 명백한 불일치는 우리가 이 작업에서 발견한 기능으로 설명될 수 있습니다. 우리의 데이터에 따르면 Hakai 가 고갈 되면 다른 MACOM 구성 요소 중 일부의 수준이 감소하지만 완전히 손실되지는 않습니다(그림 6).), 이는 나머지 MACOM이 여전히 메틸화를 지원할 수 있음을 시사합니다. 이 경우 조직 특이적 요구 사항은 이 잔류 상호작용에 영향을 미칠 수 있는 요인의 차등적 표현을 통해 중재될 수 있으며 조직 특이적 수준 m 6 A를 결정할 수 있습니다. 이 가설을 테스트하려면 추가 작업이 필요합니다.

 

척추동물에서 Hakai는 E-cadherin을 유비퀴틴화하고 분해를 촉진하는 것으로 나타났습니다 35 . 대조적으로, 초파리 세포 의 데이터는 MACOM 구성 요소 또는 다른 단백질에 대한 유비퀴틴화 활성에 대한 증거를 제공하지 않습니다. 대신, 우리의 연구는 Hakai가 효소 활성과 독립적으로 Vir, Fl(2)d 및 Flacc의 세 가지 MACOM 구성 요소의 안정성에 필요하다고 강력하게 제안합니다. 남은 문제는 하카이가 이 기능을 어떻게 발휘하느냐 하는 것입니다. 소위 "고아 단백질"은 불안정하고 공통 복합체를 구성하는 단백질 파트너가 없으면 분해된다는 것이 이전에 밝혀졌습니다. 불안정화는 비정상적인 단백질 폴딩, 변경된 국소화 또는 정상적으로 보호되는 단백질 결합 인터페이스의 노출로 인해 유발될 수 있습니다.45 . 따라서 Hakai는 이러한 메커니즘 중 하나를 통해 다른 MACOM 구성 요소를 안정화할 수 있습니다. 이 모델이 사실이라면 단지의 다른 구성 요소도 서로 안정화될 것으로 예상됩니다. 실제로, 우리는 Vir, Fl(2)d 및 Flacc의 단백질 수준이 Vir 또는 Fl(2)d의 손실 시에도 크게 감소한다는 것을 발견했습니다(그림 6 ). 흥미롭게도, MES 세포 Wtap 레벨의 강한 환원 나란히 VIRMA 손실에보고되었다 (27) 과의 강한 Zc3h13 destablization VIRMA, Wtap Hakai 또는 고갈에 관찰되었다 (34), 파리와 생쥐 사이의 Hakai-Vir-Fl(2)d-Flacc 안정화를 위한 보존된 메커니즘을 제안합니다. 우리는 Hakai와 Nito의 단백질 수준이 다른 MACOM 구성 요소의 고갈에 영향을받지 않는다는 것을 추가로 보여 주었고 Hakai와 Nito가 MACOM 또는 m 6 A-침착 과 연결되지 않은 추가 프로세스에서 기능할 수 있음을 시사합니다 . 이것은 Hakai가 또한 세포질에 위치한다는 관찰 및 나머지 MACOM 구성 요소 39 와 관련이 없는 단백질과 함께 진화적으로 보존된 단백질 복합체에서 Nito(RBM15)를 발견한 연구와 일치합니다 .

 

현재 연구에서 얻은 통찰력을 바탕으로 우리는 MACOM 어셈블리의 다음 모델을 제안합니다. (i) Fl(2)d-Vir-Hakai는 나머지 메틸트랜스퍼라제 복합체의 어셈블리 및 기능에 필요한 최소 단백질 단위를 형성합니다. (ii) Fl(2)d 및 Vir의 안정성은 서로 및 Hakai에 의존하지만 Flacc 및 Nito와는 대체로 독립적입니다. (iii) Fl(2)d-Vir-Hakai는 MAC과 상호 작용할 수 있지만 이것은 m 6 A 증착에 충분하지 않습니다 . (iv) Flacc와 Nito의 결합은 MAC과 함께 표적을 결합하고 메틸화할 수 있는 완전한 MACOM 복합체의 형성에 필수적입니다.

 

결론적으로, 우리의 작업 은 초파리 에서 m 6 A 증착에 대한 Hakai의 요구 사항을 보여주었습니다 . 서로의 안정성에 대한 Fl(2)d, Vir 및 Flacc의 명백한 종속성은 고아 소단위와 원치 않는 m 6 A 설치 의 비정상적인 상호 작용을 방지하기 위해 완전한 복합 어셈블리에 대한 단백질 화학량론의 평형을 유지하는 중요한 메커니즘일 수 있습니다 . 여러 생리학적 과정에서 m 6 A 의 중요한 역할을 고려할 때, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성에 의한 이 평형의 교란이 병리학적 상태의 발달 또는 중증도에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 해결하는 것이 중요할 것입니다.

 

행동 양식

초파리 주식과 유전학

D rosophila melanogaster CantonS를 야생형 대조군으로 사용하였다. 모든 Hakai 대립유전자 및 상응하는 염색체 결핍( Df(2L)Exel8041 및 Df(2L)Exel6044 )은 치명적인 단계를 결정하고 동형 Hakai null 동물을 수집하기 위해 actinGFP 및 w+ 로 표시된 CyO 밸런서 로 재균형되었습니다 . 유충 단계에서의 섹스는 수컷 생식선의 존재를 모니터링하여 수행되었습니다.

 

P {VSH330548) attP40 Hakai RNAi의 라인) 비엔나 초파리 자원 센터로부터 얻었다. Hakai 는 이전에 설명된 절차 46에 따라 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 생성되었습니다 . gRNA 설계 도구를 사용하여 두 개의 독립적인 가이드 RNA를 설계했습니다. www.crisprflydesign.org(보충 데이터 5). 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 pBFv-U6.2 벡터(National Institute of Genetics, Japan)에 클로닝했습니다. 벡터는 Bestgene Inc.에 의해 TBX-0002(y1, v1, P{nos-phiC31\int.NLS}X; attP40(II)) 파리의 배아에 주입되었습니다. 파리는 TBX-0008(y2 cho2 v1/Yhs -hid; Sp/CyO)는 눈 색깔 마커(Vermillon)로 양성 재조합 파리를 식별하기 위해 날아갑니다. 수컷은 CAS-0001(y2, cho2, v1; attP40(nos-Cas9)/CyO) 암컷과 더 교배되었습니다. nos -Cas9 및 U6-gRNA 이식유전자를 보유 하는 수컷 은 보충 데이터 5의 올리고를 사용하여 예상되는 결실에 대해 스크리닝되었습니다 .

 

유전자 상호 작용 연구를 위해, 우리는 사용 Mettl3의 널 (null) 와 용 다운로드 설명 등의 대립 유전자 (24) . 다 결핍이었다 Df를 (2L) BSC209 .

 

복제

면역 조직 화학 및 공동 면역 침전 분석에 사용되는 플라스미드 (그림 1d, e 참조 )는 pAC 벡터의 해당 cDNA를 N-말단 Myc-tag(Hakai short 및 Hakai long) 또는 N-말단 Myc로 클로닝하여 구성했습니다. -GFP 태그(Fl(2)d 및 Nito) 15 . C-말단 HA 태그가 있는 플라스미드의 경우 ref. 15. RING 돌연변이 작제물을 생성하기 위해 상응하는 돌연변이가 도입되었다: 위치 183의 히스티딘은 잔기 165, 168, 181, 186, 189, 198 및 201에 대한 시스테인과 조합하여 알라닌으로의 전환으로 대체되었다. 단백질의 안정성은 다음과 같았다. 이러한 돌연변이의 영향을 받지 않습니다. Hakai long 및 Ring 돌연변이체 cDNA를 BamH1 및 Xba1 부위 사이의 pUAST-eGFP-attB 벡터에 클로닝하고, 구축물을 주사를 위해 BestGene으로 보냈습니다.

 

Myc-GFP 구조는 pAc5.1B-EGFP-V5-His 벡터의 Kpn1 제한 부위 내에서 방향성 클로닝에서 Myc 태그를 클로닝하여 생성되었습니다. 이 구조는 또한 EGFP 이후 프레임에 V5-His를 가지고 있습니다. 이 구성은 실험에 대한 음성 대조군으로 사용되었습니다. 그런 다음 후속 실험을 위해 모든 cDNA를 이 벡터에 클로닝했습니다. HA 태그가 붙은 작제물의 경우 모든 cDNA를 적절한 제한 부위의 pAc5.1B-lambdaN-HA 벡터에 클로닝했습니다.

 

세포 배양, RNA 간섭 및 형질감염

초파리 S2R+ 세포는 10% FBS(Sigma) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Sigma)이 보충된 Schneider 배지(Gibco)에서 성장했습니다. RNA 간섭(RNAi) 실험을 위해 T7 메가스크립트 키트(NEB)를 사용하여 dsRNA에 대한 PCR 템플릿을 준비했습니다. 박테리아 β-갈락토시다제 유전자(lacZ)에 대한 dsRNA는 모든 RNA 간섭(RNAi) 실험에 대한 대조군으로 사용되었습니다. S2R+ 세포를 무혈청 배지에서 10 6 cells/ml 의 밀도로 시딩 하고 7.5 μg의 dsRNA를 10 6세포. 세포 기아 6시간 후, 혈청 보충 배지를 세포에 첨가하였다. dsRNA 처리는 48시간 및 96시간 후에 반복되었고 세포는 마지막 처리 24시간 후에 수집되었습니다. Effectene(Qiagen)은 제조업체의 프로토콜에 따라 모든 과발현 실험에서 벡터 구성물을 형질감염시키는 데 사용되었습니다.

 

HeLa 및 U2OS 세포의 녹다운을 위해 VIRMA(카탈로그 번호 s24832), HAKAI(카탈로그 번호 s36537) 및 음성 대조군 siRNA에 대한 siRNA를 Ambion에서 구입했습니다. siRNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000 RNAi MAX(Invitrogen)로 형질감염되었습니다.

 

초파리 세포주

Drosophila S2R+ 세포는 DGRC(Indiana University; FlyBase accession FBtc0000150)에서 얻은 배아 유래 세포였습니다. Drosophila BG3 세포는 유충 신경계에서 파생되었으며 DGRC(Indiana University; FlyBase accession FBtc0000068)에서도 얻었습니다. 두 세포주 모두 RNA-seq 실험에 의해 마이코플라스마 감염에 대해 테스트되었습니다.

 

초파리 병기

전술 한 바와 같이 스테이징 실험을 수행 하였다 (15) 를 사용 D. melanogaster의를 승 1,118 난다. 머리와 난소뿐만 아니라 각 초파리 단계 에 대해 총 3개의 독립적인 샘플을 수집했습니다 . 준비 실험에서 샘플 m 분석 RNA 추출에 사용 된 6 시 mRNA의 다른 성적 증명서의 발현 수준에서의 풍부한 초파리 개발.

 

RNA 분리 및 mRNA 정제

Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 S2R+ 세포에서 총 RNA를 분리하고 DNase I 처리(New England Biolabs)로 DNA를 제거했습니다. 3일에서 5일 된 파리의 파리 머리를 RNA 분리 전에 Trizol에서 분리하고 균질화했습니다. mRNA는 Dynabeads Oligo d(T)25(New England Biolabs)를 사용한 2회의 정제에 의해 분리되었습니다.

 

RT-PCR

cDNA는 M-MLV 역전사효소(Promega)를 사용하여 준비했습니다. Power SYBR Green PCR 마스터 믹스(Invitrogen) 및 보충 데이터 5에 표시된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 전사체 수준을 정량화했습니다 .

 

Sxl 정량화를 위해 Tri-reagent(SIGMA)를 사용하여 Total RNA를 추출하고 oligodT17V 프라이머를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 Superscript II(Invitrogen)로 역전사를 수행했습니다. Sxl 에 대한 PCR은 프라이머 Sx1 F2(ATGTACGGCAACAATAATCCGGGTAG) 및 Sxl R2(CATTGTAACCACGACGCGACGATG)를 사용하여 1㎕의 cDNA를 사용하여 40주기 동안 수행되었습니다. 실험에는 3개의 생물학적 복제가 포함되었습니다.

 

m 6 A 수준 의 LC-MS/MS 분석

LC-MS/MS 분석을 위한 mRNA 샘플은 위에서 언급한 대로 준비되었습니다. 300나노그램의 정제된 mRNA를 25mM 아세트산암모늄, pH 5에서 Penicillium citrinum(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)의 0.3U 뉴클레아제 P1 및 Crotalus adamanteus(Worthington, Lakewood, USA)의 0.1U Snake venom phosphodiesterase로 분해했습니다. 37 °C에서 2시간 동안 20 μM 염화아연을 보충했습니다. 나머지 인산염은 37°C에서 1시간 배양에서 제조업체가 제공한 완충액에서 1U FastAP(Thermo Scientific, St Leon-Roth, Germany)에 의해 제거되었습니다. 생성된 뉴클레오사이드 혼합물에 Saccharomyces cerevisiae의 13C 안정 동위원소 표지된 뉴클레오사이드 혼합물을 첨가했습니다.내부 표준으로서 RNA(SIL-IS)를 샘플 RNA의 경우 4ng/µl, SIL-IS의 경우 2ng/µl의 최종 농도로 설정합니다. 분석을 위해 앞서 언급한 혼합물 10 μl를 LC-MS/MS 기계에 주입했습니다. 기술적 삼중의 생성은 의무적이었습니다. 모든 mRNA 샘플은 생물학적 삼중으로 분석되었습니다. LC 분리는 Agilent 1200 시리즈 기기에서 5mM 암모늄 아세테이트 완충액을 용매 A로, 아세토니트릴을 완충액 B로 사용하여 수행했습니다. 각 실행은 100% 완충액 A로 시작하여 10분 이내에 92%로 감소했습니다. 추가 10분 이내에 60% 실행 23분까지 용매 A를 다시 100%로 증가시키고 컬럼을 재평형화하기 위해 7분 동안 100%로 유지했습니다(Synergi Fusion, 4 µM 입자 크기, 80 Å 기공 크기, 250 × 2.0 mm, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany). 254 nm에서 자외선 신호는 주요 뉴클레오사이드를 모니터링하기 위해 DAD 검출기를 통해 기록되었습니다. 그런 다음 MS/MS는 다음 매개변수로 설정된 Agilent JetStream ESI 소스가 장착된 결합된 Agilent 6460 Triple Quadrupole(QQQ) 질량 분석기에서 수행되었습니다. 가스 온도, 350°C; 가스 유량, 8 l/min; 분무기 압력, 50psi; 외피 가스 온도, 350°C; 외피 가스 유량, 12 l/min; 및 모세관 전압, 3,000V. 레이블이 지정되지 않은 m의 질량 전이를 분석하려면 외피 가스 유량, 12 l/min; 및 모세관 전압, 3,000V. 레이블이 지정되지 않은 m의 질량 전이를 분석하려면 외피 가스 유량, 12 l/min; 및 모세관 전압, 3,000V. 레이블이 지정되지 않은 m의 질량 전이를 분석하려면6 A 및 모든 13C m 6 A는 동시에, 우리는 동적 다중 반응 모니터링 모드를 사용 하였다.

 

TLC에 의한 m 6 A 메틸화 분석

총 RNA는 Trizol(Invitrogen)로 추출하고 올리고 dT 선택에서 PolyA mRNA는 제조업체(Promega)에 따라 준비했습니다. 각 샘플에 대해 50ng의 polyA mRNA를 RNAse T1(1000U, Fermentas)으로 절단하고 10U의 T4 PNK(NEB) 및 0.5μl [γ- 32 P] ATP(6000 Ci/mmol, 25 )를 사용하여 5'-말단 표지했습니다. μM; Perkin-Elmer) T4 PNK 버퍼에서 2시간 동안. 표지된 RNA를 침전시키고, 70% 에탄올로 2회 세척하고, 10㎕의 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5)에 재현탁시키고, 37℃에서 1시간 동안 P1 뉴클레아제(SIGMA)로 소화시켰다. 2 마이크로리터의 각 샘플을 셀룰로오스 F TLC 플레이트(20 x 20 cm; Merck)에 로드하고 이소부티르산:0.5 M NH 4 의 용매 시스템에서 실행했습니다.OH(5:3, v/v)는 첫 번째 차원이고 이소프로판올:HCl:물(70:15:15, v/v/v)은 두 번째 차원입니다. TLC는 생물학적 복제에서 반복되었습니다. 뉴클레오타이드 스폿의 정체는 14에 설명된 대로 결정되었습니다 . TLC의 스폿 강도를 정량화하기 위해 QuantityOne 소프트웨어(BioRad)와 함께 저장 형광체 스크린(K-Screen; Kodak) 및 Molecular Imager FX를 사용했습니다.

 

면역염색

Drosophila S2R+ 및 BG3 세포의 염색을 위해 , 세포를 웰당 2 x 10 5 세포 의 밀도로 8-웰 챔버(Ibidi)로 옮겼다 . 30분 후, 세포를 1x DPBS(Gibco)로 세척하고, 4% 포름알데히드로 10분 동안 고정하고, PBST(PBS 중 0.2% Triton X-100)로 15분 동안 투과화시켰다. 세포를 4°C에서 밤새 10% 당나귀 혈청이 보충된 PBST에서 마우스 항-Myc(1:2000, Enzo, 9E10) 또는 마우스 항-Flag(1:1000)와 함께 인큐베이션했습니다. 세포를 PBST에서 15분 동안 3회 세척한 다음 4°C에서 2시간 동안 10% 당나귀 혈청이 보충된 PBST에서 2차 항체 및 1x DAPI 용액과 함께 인큐베이션했습니다. PBST에서 15분 3회 세척한 후 63x 오일 침지 대물렌즈를 사용하여 Zeiss LSM 710 공초점 현미경으로 세포를 이미지화했습니다.

 

폴리텐 염색체 염색의 경우 긴 Hakai isoform이 설명된 대로 C155-GAL4 를 사용하여 타액선에서 발현되었습니다 14. 간단히 말해서, 유충은 혼잡하지 않은 조건에서 18°C에서 성장했습니다. 침샘을 4% 포름알데히드와 1% TritonX100이 포함된 PBS에 해부하고 5분 동안 고정한 다음 4% 포름알데히드를 포함하는 50% 아세트산에서 2분 동안 고정한 후 락토아세트산(젖산:물:아세트산 산, 1:2:3). 그런 다음 염색체를 실리콘 처리된 커버 슬립 아래에 펴고 동결 후 커버 슬립을 제거했습니다. 0.2% BSA 및 5% 염소 혈청을 함유하는 PBT에서 염색체를 차단하고 1차 항체(마우스 항-Pol II H5 IgM, 1:1000, Abcam 및 래트 항-HA MAb 3F10, 1:50, Roche)와 함께 순차적으로 배양했습니다. DAPI(1 µg/ml, Sigma)를 포함한 Alexa488 및/또는 Alexa647 결합 2차 항체(Molecular Probes)와의 배양에 의해.

 

초파리 MACOM 서브유닛 의 공동 면역침전 분석 및 웨스턴 블롯 분석

그림 1e, f에 표시된 공동 면역 침전 분석의 경우 표시된 태그가 있는 벡터의 다양한 조합이 S2R+ 세포에서 공동 형질감염되었습니다. 형질감염 48시간 후, 세포를 수집하고, DPBS로 세척하고, 10분 동안 400×g에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 1ml의 용해 완충액(50mM Tris-HCl at pH 7.4, 150mM NaCl , 0.05% NP-40) 프로테아제 억제제가 보충되고 4°C에서 15분 동안 꼬리 위로 머리를 회전했습니다. 4°C에서 10분 동안 1000 x g 에서 원심분리하여 핵을 수집하고  , 300μL의 용해 완충액에 재현탁하고, 저전력 설정에서 30초 켜기 및 30초 끄기의 5주기로 초음파 처리했습니다. 세포질 및 핵 분획을 결합하고 18,000 x g 에서 원심분리했습니다. 나머지 세포 파편을 제거하기 위해 4°C에서 10분 동안. 단백질 농도는 Bradford 시약(Bio-Rad)을 사용하여 결정되었습니다. 면역 침전을 위해 2mg의 단백질을 용해 완충액에서 단백질 A/G 자기 비드(Cell Signalling)에 결합된 2㎍의 항-Myc 항체와 함께 인큐베이션하고 4°C에서 밤새 머리 위로 꼬리를 회전시켰다. 비드를 용해 완충액으로 15분 동안 3회 세척하고, 면역침전된 단백질을 70°C에서 10분 동안 1X NuPAGE LDS 완충액(Thermo Fisher)에서 인큐베이션하여 용출시켰다. 용출된 면역침전 단백질을 비드에서 제거하고 DTT를 최종 부피의 10%로 첨가하였다. 면역침전된 단백질 및 입력 샘플을 95°C에서 추가 5분 동안 인큐베이션한 후 웨스턴 블롯으로 분석했습니다. 웨스턴 블롯 분석의 경우, 단백질을 8% SDS-PAGE 젤에서 분리하고 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad)으로 옮겼습니다. 실온에서 1시간 동안 PBS 중 0.05% Tween의 5% 우유로 차단한 후, 막을 4°C에서 밤새 차단 용액에서 1차 항체와 함께 인큐베이션했습니다. 사용된 1차 항체는 마우스 항-Myc 1:2000(#9E10, Enzo); 마우스 항-HA 1:1000(#16B12, COVANCE); 마우스 항-튜불린 1:2000(#903401, Biolegend); 마우스 항-Fl(2)d 1:500(#9G2, DSHB), 기니피그 항-Mettl3 1:500 및 토끼 항-Mettl14(Lence et al. 2016) 1:250 15분 동안 차단하고 용액에서 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. SuperSignalWest Pico 화학발광 기질(Thermo Scientific)을 사용하여 단백질 밴드를 검출했습니다. 실온에서 1시간 동안 PBS 중 05% 트윈, 막을 4°C에서 밤새 차단 용액 중 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 사용된 1차 항체는 마우스 항-Myc 1:2000(#9E10, Enzo); 마우스 항-HA 1:1000(#16B12, COVANCE); 마우스 항-튜불린 1:2000(#903401, Biolegend); 마우스 항-Fl(2)d 1:500(#9G2, DSHB), 기니피그 항-Mettl3 1:500 및 토끼 항-Mettl14(Lence et al. 2016) 1:250 15분 동안 차단하고 용액에서 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. SuperSignalWest Pico 화학발광 기질(Thermo Scientific)을 사용하여 단백질 밴드를 검출했습니다. 실온에서 1시간 동안 PBS 중 05% 트윈, 막을 4°C에서 밤새 차단 용액 중 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 사용된 1차 항체는 마우스 항-Myc 1:2000(#9E10, Enzo); 마우스 항-HA 1:1000(#16B12, COVANCE); 마우스 항-튜불린 1:2000(#903401, Biolegend); 마우스 항-Fl(2)d 1:500(#9G2, DSHB), 기니피그 항-Mettl3 1:500 및 토끼 항-Mettl14(Lence et al. 2016) 1:250 15분 동안 차단하고 용액에서 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. SuperSignalWest Pico 화학발광 기질(Thermo Scientific)을 사용하여 단백질 밴드를 검출했습니다. 코반스); 마우스 항-튜불린 1:2000(#903401, Biolegend); 마우스 항-Fl(2)d 1:500(#9G2, DSHB), 기니피그 항-Mettl3 1:500 및 토끼 항-Mettl14(Lence et al. 2016) 1:250 15분 동안 차단하고 용액에서 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. SuperSignalWest Pico 화학발광 기질(Thermo Scientific)을 사용하여 단백질 밴드를 검출했습니다. 코반스); 마우스 항-튜불린 1:2000(#903401, Biolegend); 마우스 항-Fl(2)d 1:500(#9G2, DSHB), 기니피그 항-Mettl3 1:500 및 토끼 항-Mettl14(Lence et al. 2016) 1:250 15분 동안 차단하고 용액에서 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. SuperSignalWest Pico 화학발광 기질(Thermo Scientific)을 사용하여 단백질 밴드를 검출했습니다.

 

다른 그림에 표시된 공동 면역침전 분석의 경우 다음과 같이 수정했습니다. 세포를 형질감염 72시간 후에 수확하고 DPBS로 한 번 세척했습니다. 세포 펠렛을 0.5ml의 NET 완충액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Triton 및 프로테아제 억제제 및 10% 글리세롤이 보충된 1mM EDTA pH 8.0)에 용해시키고 30초의 3주기 동안 초음파 처리했습니다. 고출력 설정에서 얼음에서 30분 동안 RNase A와 함께 인큐베이션한 후 용해물을 15,000 x g 에서 원심분리했습니다. 4°C에서 10분 동안 샘플의 10%를 입력 샘플로 꺼내고 나머지는 4°C에서 머리에서 발끝까지 회전 믹서에서 GFP-자기 비드와 함께 배양했습니다. 비드를 NET 완충액으로 15분 동안 3회 세척하고, 100mM DTT가 보충된 SDS-페이지 로딩 염료에서 95°C에서 3분 동안 비드를 끓임으로써 단백질을 용출시켰다. 해당되는 경우 "세포 배양, RNA 간섭 및 형질감염"에 설명된 대로 표시된 단백질의 고갈을 수행했습니다. 해당 그림 범례에 표시된 대로 두 배 양의 구성물이 여러 조건에서 형질감염되었습니다.

 

인간 MACOM 서브유닛의 공동 면역침전 분석 및 웨스턴 블롯 분석

인간 MACOM 서브유닛의 공동 면역침전 분석을 위해, 인간 MACOM 구성요소의 선택된 절단을 His 6 -HA 3 -mCherry- 또는 His 6 -FLAG 3 -eGFP- 태그가 있는 pcDNA3 유래 벡터에 개별적으로 클로닝했습니다 . 0.25백만 HEK293T 세포를 6웰 플레이트의 2ml 배지에 접종하고 ~24시간 동안 성장시키고(~75% confluency에 도달 ) 1:3 비율로 Xtreme ® 형질감염제(Roche)를 사용하여 상응하는 플라스미드(각각 1μg )로 형질감염시켰다. 세포를 PBS로 세척하고 Roche 프로테아제 억제제가 보충된 용해 완충액(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM KCl, 1mM EDTA, 0.1% Tween20)을 사용하여 형질감염 후 ~48시간 후에 세포를 수확했습니다. 그런 다음 세포를 액체 질소에서 급속 동결하고 -80 °C에서 보관했습니다.

 

해동 시, 세포는 10% 진폭에서 30초(0.5초 켜기/2초 끄기) 동안 초음파 처리에 의해 추가로 용해되었습니다. RNA 매개 상호작용을 배제하기 위해 2μg RNase A를 추가했습니다. 가용성 분획을 최대 속도로 15분 동안 원심분리하여 분리하고 ~18μl의 자기 항-FLAG M2 비드(Sigma)와 함께 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 비드를 용해 완충액으로 3-4회 세척하였다. 생성된 비드를 SDS 로딩 염료와 직접 혼합하고 4-20% SDS 겔(Biorad)에 로딩하였다. 각각 473 nm 및 532 nm의 Typhoon FLA 9500 필터를 사용하여 GFP 및 mCherry 신호에 대해 젤을 스캔했습니다.

 

MycGFP-Fl(2)d 및 MycGFP-Nito의 면역침전 및 유비퀴틴화 분석

S2R+ 세포는 위에서 설명한 대로 MycGFP-tagged Nito 또는 Fl(2)d 단백질로 형질감염되었습니다. 10-cm 세포 배양 접시에 있는 형질감염 후 48시간에 부착된 세포를 얼음 위의 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 완전한 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 1ml의 변형된 RIPA 용해 완충액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% Na-데옥시콜레이트)으로 세포를 용해시켰다. 5mM 베타-글리세로포스페이트, 5mM NaF, 1mM Na-오르토바나데이트, 10mM N-에틸말레이미드. 그런 다음 세포를 수집하고 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션하고 16,000 x g 에서 15분 동안 원심분리했습니다. 4 ° C에서. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 Bradford를 사용하여 단백질 농도를 측정했습니다. 1.5 mg의 단백질을 20 μL의 세척된 GFPTrap-A 비드(Chromotec)와 함께 4°C 엔드 오버 엔드 혼합에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 비드를 원심분리(3000rpm, 1분)로 수집하고 상청액을 제거했습니다. 비드를 희석 완충액(10mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1X 프로테아제 억제제(Sigma), 10mM N-에틸말레이미드)으로 1회 세척하고, 엄격한 세척 완충액(8M 우레아)으로 3회 세척했습니다. , 1X PBS 중 1% SDS) 및 세척 완충액으로 1X(1X PBS 중 1% SDS). 1mM DTT가 보충된 40마이크로리터의 2x LDS 샘플 완충액(Invitrogen)을 첨가하고 비드를 70℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 용출된 단백질의 25%가 WB로 분석되었습니다. 사용된 1차 항체는 다음과 같습니다: 마우스 항-Myc 1:2000(#9E10,

 

나머지 75%의 용출된 단백질은 유비퀴티놈 및 프로테옴 분석에 사용되었습니다. 단백질을 암실에서 30분 동안 5.5mM CAA로 알킬화하고, Colloidal Blue Staining Kit(Life Technologies)를 사용하여 염색하고, 트립신을 사용하여 겔 내에서 분해했습니다. 겔에서 펩티드를 추출하고 역상 C18 StageTips 47 에서 탈염했습니다 . 그런 다음 샘플을 MS 및 펩티드 식별에 적용했습니다.

 

세포 배양에서 아미노산에 의한 안정 동위원소 표지(SILAC)

SILAC 실험(Hakai 고갈 세포의 유비퀴티놈 및 프로테옴)의 경우, S2R+ 세포는 6-8 계대 동안 무거운(Arg10, Lys8) 또는 가벼운 아미노산(Arg0, Lys0)(Sigma)이 보충된 Schneider 배지(Dundee Cell)에서 성장되었습니다. 성공적인 통합은 LC-MS/MS에 의해 확인되었습니다.

 

S2R+ 세포의 유비퀴틸롬 및 프로테옴 분석

대조군 및 Hakai 고갈된 SILAC S2R+ 세포 또는 Fl(2)d/Vir 고갈된 S2R+ 세포의 유비퀴틸롬 및 프로테옴 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다 43 , 48. 다음과 같은 변형이 이루어졌습니다: S2R+ 세포는 중(Arg10, Lys8) 또는 경질 아미노산(Arg0, Lys0)(Sigma)이 보충되거나 무표지 단백질체(Fl(2 )d 및 Vir KD). 다른 인자의 고갈은 해당 이중 가닥 RNA로 6일 동안 3회 수행되었으며 복제당 50mg의 단백질을 얻기 위해 확장되었습니다(8-10, 15cm 세포 배양 접시). 세포 용해 6시간 전에 MG132 프로테아좀 억제제를 15μM의 최종 농도로 첨가하였다. 세포는 완전한 프로테아제 억제제 칵테일(Roche), 5mM이 보충된 변형된 RIPA 용해 완충액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% Na-데옥시콜레이트)에서 용해되었습니다. 글리세로포스페이트, 5mM NaF, 1mM Na-오르토바나데이트, 10mM N-에틸말레이미드. 1. 각 15cm 접시당 5ml의 완충액을 사용했습니다. 동일한 형질감염의 모든 용해물을 팔콘에서 결합하고 단백질 농도를 Bradford에 의해 측정했습니다. WB 분석을 위해 각 단백질 샘플의 수백 마이크로그램을 수집했습니다. 유비퀴틸롬 및 프로테옴 분석을 위해 25mg의 무거운 단백질 용해물과 25mg의 가벼운 표지된 단백질 용해물을 다음과 같이 1:1 비율로 결합했습니다: 전방 실험을 위해 Hakai KD가 있는 무거운 표지된 용해물과 대조 KD가 있는 가벼운 표지된 용해물이 결합되었으며 그 반대도 마찬가지입니다. 역 실험을 위해. 그런 다음 프로테옴 분석을 위해 50μg을 수집했습니다. 마지막으로, 얼음처럼 차가운 아세톤을 80% 최종 농도에 첨가했습니다. (4xV) 및 -20°C에서 O/N을 침전시키고 MS에 적용했습니다. WB 분석을 위해 각 단백질 샘플의 수백 마이크로그램을 수집했습니다. 유비퀴틸롬 및 프로테옴 분석을 위해 25mg의 무거운 단백질 용해물과 25mg의 가벼운 표지된 단백질 용해물을 다음과 같이 1:1 비율로 결합했습니다: 전방 실험을 위해 Hakai KD가 있는 무거운 표지된 용해물과 대조 KD가 있는 가벼운 표지된 용해물이 결합되었으며 그 반대도 마찬가지입니다. 역 실험을 위해. 그런 다음 프로테옴 분석을 위해 50μg을 수집했습니다. 마지막으로, 얼음처럼 차가운 아세톤을 80% 최종 농도에 첨가했습니다. (4xV) 및 -20°C에서 O/N을 침전시키고 MS에 적용했습니다. WB 분석을 위해 각 단백질 샘플의 수백 마이크로그램을 수집했습니다. 유비퀴틸롬 및 프로테옴 분석을 위해 25mg의 무거운 단백질 용해물과 25mg의 가벼운 표지된 단백질 용해물을 다음과 같이 1:1 비율로 결합했습니다: 전방 실험을 위해 Hakai KD가 있는 무거운 표지된 용해물과 대조 KD가 있는 가벼운 표지된 용해물이 결합되었으며 그 반대도 마찬가지입니다. 역 실험을 위해. 그런 다음 프로테옴 분석을 위해 50μg을 수집했습니다. 마지막으로, 얼음처럼 차가운 아세톤을 80% 최종 농도에 첨가했습니다. (4xV) 및 -20°C에서 O/N을 침전시키고 MS에 적용했습니다. 그런 다음 프로테옴 분석을 위해 50μg을 수집했습니다. 마지막으로, 얼음처럼 차가운 아세톤을 80% 최종 농도에 첨가했습니다. (4xV) 및 -20°C에서 O/N을 침전시키고 MS에 적용했습니다. 그런 다음 프로테옴 분석을 위해 50μg을 수집했습니다. 마지막으로, 얼음처럼 차가운 아세톤을 80% 최종 농도에 첨가했습니다. (4xV) 및 -20°C에서 O/N을 침전시키고 MS에 적용했습니다.

 

라벨이 없는 프로테옴

총 15 × 10 6S2R+ 세포는 10-cm 세포 배양 접시에서 Myc-GFP-tagged HAKAI-long isoform으로 형질감염되었습니다. 동시에, 세포를 음성 대조군으로 Myc-GFP로 형질감염시켰다. 72시간 후, 세포를 수확하고 차가운 PBS로 세척하였다. 세포를 1ml의 NET 완충액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Triton 및 1mM EDTA pH 8.0)으로 용해하고 10% 글리세롤 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)로 보충했습니다. 용해물을 고전력 설정에서 30초의 3주기 동안 초음파 처리한 다음 얼음 위에서 30분 동안 RNAse A와 함께 인큐베이션한 후 용해물을 4°C에서 10분 동안 15,000 x g에서 원심분리했습니다. 제거된 용해물을 4°C에서 2시간 동안 머리에서 발끝까지 회전 믹서에서 GFP-자기 비드와 함께 인큐베이션했습니다. 비드를 NET 완충액으로 15분 동안 3회 세척하고, 단백질을 NuPAGE 완충액에서 70°C에서 인큐베이션하여 용출시켰다.

 

단백질체 및 유비퀴틸롬 분석

MS 샘플 준비, 프로테옴 분석, MS 및 펩티드 식별은 ref. 48 . SILAC 샘플에서 펩타이드 식별을 위해 원시 데이터 파일은 MaxQuant(개발 버전 1.5.2.8)를 사용하여 분석되어 서로 다른 조건 사이의 비율을 계산했습니다 49 . MaxQuant 분석을 위해 다른 매개변수 그룹을 사용하여 복제 2(역)에서 SILAC 비율을 반전시키기 위해 그룹별 매개변수를 정의했습니다. 이러한 설정의 결과로 두 실험 모두에서 H/L은 HAKAI KD/비타겟팅 컨트롤을 나타냅니다. 모든 정량 ubiquitylation 사이트 (디 글리신 사이트) 단백질 군으로 데이터 Supplementary_Data_로 제공된다 (3) (ubiquitylome 분석) 및 Supplementary_Data 4 (프로테옴 분석).

 

라벨이 없는 샘플의 분석은 MaxQuant(1.5.2.8) 및 Perseus 소프트웨어 버전 1.5.6.0의 LFQ 분석에 대한 기본 설정을 사용하여 수행하여 p 값 및 스튜던트 t 테스트 50 계산을 수행했습니다 . 부모 이온 및 MS2 스펙트럼은 Andromeda 검색 엔진 51을 사용하여 2016년 5월에 릴리스된 UniProtKB에서 얻은 D. melanogaster 단백질 서열을 포함하는 데이터베이스에 대해 검색했습니다 .

 

효모 2 하이브리드 분석(Y2H)

효모-2-하이브리드 분석은 S. cerevisiae를 사용하여 수행되었습니다 .효모 균주 [trp1-901, leu2-3,112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1-HIS3, GAL2-ADE2, met2::GAL7-lacZ]. 테스트된 모든 유전자(Mettl3, Mettl14, Fl(2)d, Vir, Nito, Flacc, Hakai)의 cDNA를 벡터 pGAD424-GW 및 pGBT9-GW에 클로닝하고 Leu2 및 Trp1 마커(Helle Ulrich Lab, IMB 제공) Mainz)는 각각 C-말단 Gal4-활성화 도메인 또는 C-말단 Gal4-DNA 결합 도메인을 가진 모든 후보를 발현합니다. 간단히 말해서, 효모 세포는 OD = 0.6에 도달할 때까지 YPD 배지에서 성장했습니다. 세포를 실온에서 7분 동안 3500rpm으로 원심분리하고 물로 1회, SORB(100mM LiOAc, 10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0, 1M 소르비톨)로 1회, 물로 1회 세척하였다. SORB 100ml. 펠렛을 3.6 ml의 SORB에 재현탁시키고 400 ml의 ssDNA 담체를 적격 세포에 첨가하였다. 50마이크로리터의 세포 분취량을 100ng의 플라스미드 DNA와 혼합했습니다. 이어서, 6x 부피의 PEG 용액(10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0, 40(w/v)-% PEG 3350)을 실온에서 30분 동안 추가로 인큐베이션한 세포-DNA 혼합물에 첨가하였다. 다음으로, DMSO의 1/9을 42°C에서 15분 열 충격을 받은 세포에 첨가했습니다. 1968년에서 2분 원심분리 후 × g 및 RT에서, 세포 펠릿을 500μL의 물에 재현탁시키고 100μL의 세포 용액을 Trp-/Leu-선택 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 30°C에서 3일 동안 배양한 후, 각 형질전환의 5개 콜로니를 500μL의 물에 재현탁하고 4μL를 선택 한천 플레이트(Trp-/Leu- 및 Trp-/Leu-/His-)에 스팟팅했습니다. 플레이트는 24시간 간격으로 이미지화되었습니다.

 

RNA-seq 분석

원시 데이터 처리, 차등 발현 분석 및 스플라이싱 분석은 ref. 24 . GSE105900의 모든 샘플과 GSE158663의 Hakai 샘플은 동일한 도구 및 도구 버전으로 동시에 처리되었습니다. 차등 접합 및 차등 발현 분석에 대한 참조로 사용되는 컨트롤은 동일합니다. 간단히 말해서 라이브러리는 85bp 단일 읽기의 읽기 길이로 NextSeq500에서 시퀀싱되었고 bcl2fastq(v.2.19)를 사용하여 fastq로 전환되었으며 STAR( 52 , v. 2.5.10)를 사용하여 D. melanogaster 의 Ensembl 릴리스 90에 대해 매핑되었습니다 . ). 유전자당 카운트는 featureCounts( 53 , v. 2.5.1)를 사용하여 파생되었으며 , 차등 발현 분석은 Bioconductor/DESeq2(54 , v1.16.1)) FDR < 5%에 대해 필터링되었으며 기본 독립 필터링이 사용되었습니다. rMATS( 55 , v. 3.2.5)를사용하여 차등 스플라이싱 분석을 수행하고 FDR < 10%에 대해 필터링했습니다.

 

통계

m 6 A 레벨 측정 데이터 세트는 비 균등 분산에 대한 양측 스튜던트 t 테스트를 사용하여 비교되었습니다 . Control, Metll3, Nito, Vir, Flacc 및 Hakai KD의 Fl(2)d 수준 은 등분산에 대한 양측 스튜던트 t 검정을 사용하여 비교되었습니다 . Levene's test로 정규성을 검증하고 분산의 동질성을 분석하였다. 신뢰 구간, 효과 크기, 자유도에 대한 자세한 설명은 소스 데이터에 나와 있습니다. RNAseq 데이터 분석 및 질량 분석에 사용되는 통계 테스트는 "방법" 부분의 관련 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.

 

보고 요약

연구 설계에 대한 추가 정보는 이 기사에 링크된 Nature Research 보고 요약 에서 확인할 수 있습니다 .