리유비퀴틴 유전자 Ubb 는 마우스 고환 발달 중 Piwi 단백질 수준의 상향 조절에 필요합니다

리유비퀴틴 유전자 Ubb 는 마우스 고환 발달 중 Piwi 단백질 수준의 상향 조절에 필요합니다

초기 배아 생식선 형성과 늦은 출생 후 정자 형성을 포함한 고환 발달은 정자라고 불리는 수정 가능한 배우자를 생성하기 위해 고등 후생 동물의 번식에 필수적입니다.

 

우리는 이전에 폴리유비퀴틴 유전자 Ubb 가 수컷 및 암컷 마우스 모두의 생식력에 필요 하다고 보고했습니다 . 특히, Ubb- null 수컷 마우스는 파키텐 단계에서 정자 형성의 정지로 인해 무정자증 표현형을 보였다. 여기에서 우리는 Ubb 녹아웃으로 인한 남성 불임 표현형의 분자 매개체를 정의하기 위해 출생 후 20일째에 전체 고환 단백질체를 분석했습니다 . 확인된 proteome에서 564개의 단백질이 Ubb-녹아웃 고환과 이들 중 36개의 하향 조절된 단백질이 정자 형성의 여러 단계에 관여했습니다. 우리는 또한 기능 유전자 온톨로지 분석을 통해 Piwil2 및 Tdrd1을 포함한 piRNA 대사 과정 관련 단백질의 수준이 Ubb -null 고환 에서 하향 조절된다는 것을 발견했습니다 . 또한, 단백질-단백질 상호작용 매핑은 Hsp90aa1, Eef1a1 및 Pabpc1을 포함한 24개의 고환 발달 관련 단백질이 유비퀴틴의 고갈에 직접적인 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 또한, 이들 단백질의 감소된 mRNA 수준은 Ubb-녹아웃 고환은 전사 및 전사 후 수준에서 piRNA-대사 유전자 발현의 전체적인 하향 조절과 매우 유사했습니다. proteomic 및 전사 분석과 함께 우리의 데이터는 Ubb 발현이 마우스에서 정자 형성을 완료하기 위해 고환 RNA-결합 조절인자와 piRNA-대사 단백질의 유지에 필수적 임을 시사합니다 .

 

소개

유비퀴틴(Ub)은 포유동물의 모노유비퀴틴 및 폴리유비퀴틴 유전자에 의해 인코딩되는 고도로 보존된 진핵 단백질입니다[ 1 , 2 , 3 ]. 마우스에서 2개의 모노유비퀴틴 유전자( Uba52 및 Uba80 )는 각 리보솜 단백질과 융합된 단일 Ub를 암호화하고, 2개의 폴리유비퀴틴 유전자( Ubb 및 Ubc )는 각각 4 또는 9개의 Ub 코딩 단위의 직렬 반복을 포함합니다[ 4 ]. 합성 셀룰러 UB, 드 노보 로 정의 잘 연구 생화학 반응을 자유롭게 사용할 유비퀴틴 - 촉매 E1, E2 및 E3 효소 [의해 5]. 지금까지 많은 연구에서 수백 가지의 서로 다른 세포 내 단백질이 모노유비퀴틴화 또는 폴리유비퀴틴화되어 있음을 보여주었습니다[ 6 ]. 이러한 복잡한 Ub 신호는 Ub 결합 도메인을 가진 수용체 단백질에 의해 정확하게 인식되어 DNA 복구, 세포 주기 조절, 단백질 분해 및 세포 신호 전달과 같은 광범위한 생물학적 기능을 수행합니다[ 6 ]. 따라서 세포 내 Ub 수준을 유지하기 위해서는 모노유비퀴틴 유전자가 항상 높게 발현되고, 폴리유비퀴틴 유전자도 높은 수준으로 발현되는데, 이는 세포 상태에 따라 조절될 수 있다[ 7 , 8 , 9 ]. 대조적으로, Uba52의 녹아웃에 의한 세포내 Ub 수준의 고갈또는 Ubc 는 초기 단계에서 배아 발달의 실패로 이어집니다[ 10 , 11 ].

 

초기 배아 단계에서 출생 후 성인기에 이르기까지 쥐의 고환은 몇 가지 중요한 단계를 거쳐 계속 발달합니다[ 12 ]. 초기 배아 단계에서 이동하는 원시 생식 세포(PGC)는 중배엽의 특정 영역에서 발생하여 이후에 성 결정에 참여합니다[ 13 ]. 또한 고환 체세포는 Sertoli 세포로 분화하고 PGC와 함께 배아 생식선을 형성합니다[ 14 ]. 출생 후, 고환 체세포 및 생식 세포가 증식하고 성숙하며, 정자는 이후 감수 분열을 포함한 정자 형성을 겪습니다. 또한, 고환 발달을 달성하고 성숙한 정자를 성공적으로 생산하기 위해 후성 유전적 조절, 세포 신호 및 내분비 시스템이 엄격하게 제어됩니다[ 15 ].

 

불임 분야의 최근 연구는 단일 정자 생성 인자에만 초점을 맞추었습니다[ 16 , 17 , 18 ]. 포유류 고환의 단백질 수준에서 Ubb 에 의해 영향을 받는 생식 관련 요인에 대한 프로파일링이 있는 연구는 거의 없습니다 . Lan-Tao et al. 최근에 Piwi-like protein(Piwil)의 D-box 영역 돌연변이가 정자 생성 후기 동안 Rnf8의 결합을 감소시켜 Piwil의 분해와 생쥐의 불임을 초래한다는 것을 보여주었다[ 17 ]. Li et al. 면역 침전 질량 분석기를 사용하여 Dazl과 Pabpc1 사이의 상호 작용을 확인했습니다 [ 16]. 정자 형성의 진행에 핵심적인 많은 정자 형성 인자의 번역은 Pabpc1에 의해 조절됩니다. 또한, 불임과 Dazl 사이의 연관성은 Dazl의 결핍으로 인해 접합체/파키텐-전환 단계에서 정지된 세포의 단일 단백질 수준에서 확인되었다. Huang et al. 는 44개의 유비퀴틴화된 단백질이 성체 버팔로의 고환에서 친화력 강화 방법을 통해 얻은 유비퀴틴화된 펩타이드의 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS) 분석을 사용하여 정자 생성과 관련이 있음을 확인했습니다[ 18 ].

 

우리는 이전에 Ubb- 녹아웃 마우스가 생존할 수 있지만 두 가지 현저한 표현형, 즉 성인 발병 시상하부 신경변성 및 수컷 및 암컷 마우스 모두에서 불임을 보고했다고 보고했습니다 [ 19 , 20 ]. Ubb- 넉아웃 마우스 의 불임은 출생 후 생식선의 발달 결함으로 인해 배우자 형성 실패로 인해 발생합니다. 특히, Ubb- 넉아웃 마우스 의 고환과 난소는 야생형(WT) 마우스보다 작으며, 성적으로 성숙함에 따라 크기 차이가 커집니다[ 20 ]. 또한, 생식 세포의 감수 분열 세포 주기 정지는 Ubb 에서 무정자증으로 이어집니다-null 수컷 마우스, 반면 고환의 다른 체세포는 정상입니다. 고환 생식 세포에서 Ubb 의 발현 수준은 고환 체세포에서보다 상대적으로 높기 때문에 Ub 수준이 더 크게 감소합니다[ 20 ]. 전사체 분석을 포함하여 Ubb- 녹아웃 고환 의 발달 결함 메커니즘에 대한 철저한 조사 가 있었지만, 감소된 Ub 수준이 감수성 세포 주기 정지로 이어지는 방법은 여전히 ​​불분명합니다[ 21 ].

 

여기에서 우리 는 정자를 생성하기 시작한 출생 후 20일(P20)과 배아 14.5일(E14.5) 에 WT 및 Ubb -/- 고환에 초점을 맞추어 세포 Ub 결핍으로 인한 분자 교란을 조사했습니다. 우리는 Ub- 결핍 정자에서 감수 분열 세포 주기 정지와 관련된 주요 단백질을 식별하기 위해 WT와 Ubb - / - 고환 사이의 최첨단 질량 분석 기반 정량적 단백질체학 을 사용했습니다. 우리의 데이터는 마우스 고환 단백질체를 프로파일링하고 정자 형성의 다양한 단계에서 Ubb 의 역할을 매핑하기 위한 풍부한 리소스를 제공합니다 .

 

결과

Ubb- 녹아웃 마우스 모델 의 고환에서 발현되는 전체 단백질의 프로파일링

Ubb 파괴의 근본적인 변화를 확인하기 위한 단백질체 분석 전에 , 우리 는 출생 20일째에 4마리의 WT와 3 마리의 Ubb -/- 수컷 마우스에서 고환 조직을 분리 했습니다. -MS/MS(그림 1a ). 총 8105개의 고환 단백질이 확인되었으며, 이 중 6511개의 단백질이 상대적 비교를 위해 정량화될 수 있었습니다. 다음으로, 2개 샘플 t-검정 을 수행하고 p 값이 < 0.05이고 발현이 ±1.2배 변화 하는 단백질을 유의미한 것으로 간주하여 DEP로 선택하였다. 총 564개의 단백질이 Ubb 에서 차등적으로 발현되었습니다 -/-고환은 p 값 임계값 을 충족하는 277개의 상향 조절된 단백질 및 287개의 하향 조절된 단백질을 포함하여 WT 대조군과 비교되었습니다 (그림 1b , 보충 표 2 ). Ubb 파괴의 영향을 받는 단백질 순위 목록에 대한 통찰력을 얻기 위해 발현 수준의 차이를 보인 단백질은 log 2 배 변화(log 2 FC) 값을 기반으로 순위가 매겨졌습니다 . 정자 생성과 관련된 많은 단백질(예: Piwil1, Tdrd6, Piwil2, Tdrd1 및 Pabpc1)은 Ubb -/- 에서 감소된 발현 수준을 보였고 대부분 가장자리 쪽으로 순위가 매겨졌습니다(그림 1c).). Wei et al.의 데이터와 데이터를 비교하면 5863개의 단백질이 우리의 데이터와 일치하고[ 22 ] 정자 생성 데이터베이스에서 403개의 단백질이 확인되었음을 발견했습니다[ 23 ](그림 1d ). 403개의 정자 생성 관련 단백질 중 LC-MS/MS 분석을 사용하여 감수 분열 단계에 관여하는 108개 단백질과 감수 분열 후 단계에 관여하는 104개 단백질을 확인했습니다(그림 1e , 보충 표 3 ). 흥미롭게도 Ubb 파괴로 인해 하향 조절된 36개의 단백질이 정자 형성의 다양한 단계에 관여했으며, 이는 Ub 결핍으로 인한 감수 분열 정지에 대한 이전 보고서와 일치합니다 [ 16 , 18 , 21, 23 , 24 ]. 또한 Eif4g3, Hsp90aa1, Tdrd9, Sycp2를 포함한 11개의 단백질이 정자세포에 관여하여 WT 대조군에 비해 비정상적으로 낮은 발현량을 보였다. 정자 성숙의 정자 단계에 관여하는 Ddx4, Tdrd6, Tdrd7 및 Rnf17을 포함한 8개 단백질의 수준도 하향 조절되었습니다(보충 표 3 ). 종합하면, 우리의 proteomic profiling은 Ubb 중단이 정자 생성과 관련된 생물학적 기능의 넓은 범위를 교란시키는 것으로 나타났습니다 .

 

그림 1: 전체 실험 과정 및 전역 프로테옴 프로파일링 결과.

그림1

a 프로테옴 분석을 위해 4마리의 WT 및 3 마리의 Ubb -/- (KO) 마우스 의 고환에서 조직 샘플을 처리하기 위해 따랐던 방법의 개요 . b 식별된 프로테옴 및 차등적으로 발현된 단백질에 대한 화산 플롯 표현. 빨간색과 파란색 점은 통계적 기준(학생의 t-검정 , p- 값 < 0.05, 빨간색은 log2fc> 1, 파란색은 하향 조절됨 )과 함께 각각 상당히 상향 조절된 단백질과 하향 조절된 단백질을 나타냅니다 . c log2 변환 배수 변화를 기반으로 한 하향 조절된 단백질에 대한 단백질 순위 플롯. NS정자 생성 데이터베이스의 단백질 벤다이어그램(빨간색 원), 현재 연구에서 LC-MS/MS 분석으로 식별된 단백질(노란색 원), Wei et al.에서 식별된 단백질(파란색 원). e Spermatogenesis 온라인 데이터베이스 기반 프로파일링된 단백질의 고환 세포 유형 특성화.

 

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DEP의 기능적 농축 유전자 온톨로지 분석(WT 대 Ubb- 녹아웃)

다음으로, Ubb 파괴 와 관련된 고환 단백질을 특성화하기 위해 농축 분석을 수행했습니다 . GO 분석은 생물학적 과정, 세포 성분 및 Ubb -null 상태 의 다양한 경로에서 DEP의 농축을 보여주었습니다 . GO 분석을 위해 오픈 소스 소프트웨어인 g:profiler를 사용 했으며 g:scs 알고리즘을 사용하여 통계적 농축 분석을 통해 Ubb 관련 단백질 의 기능적 프로파일링을 수행했습니다. Ubb의 결실로 인해 발현이 감소된 단백질 은 주로 섬모와 관련된 생물학적 과정, 세포 성분 및 경로가 풍부했으며 p-g:SCS를 사용하여 얻은 값은 매우 낮았습니다. 유성 생식, 섬모 조직 및 piRNA 대사 과정과 같은 풍부한 생물학적 과정은 Ubb -/- 고환 에서 적극적으로 하향 조절 된 반면 (그림 2a ), 상향 조절 된 단백질은 주로 세포 구성 요소 조직, 발달 과정과 같은 과정에서 풍부했습니다. , 및 세포 골격 조직(보충 표 4 ). 우리는 또한 감수 분열 방추, 섬모, 리보핵단백질 복합체, 염색체체 및 p-과립을 포함하여 감소된 풍부함을 갖는 단백질이 풍부한 세포 성분을 관찰했습니다(그림 2b).). 또한, 상향 조절된 단백질은 세포 접합부, 세포-세포 접촉 영역, 막 영역 및 세포외 기질과 연관되었습니다(보충 표 4 ). 특히, 우리는 해당 분해/포도당 생성 및 섬모 조립과 관련된 감소된 단백질 풍부도를 관찰했습니다. 또한, Hedgehog "오프" 상태 리액톰에 풍부한 단백질은 하향 조절된 단백질을 포함합니다(그림 2c ). 대조적으로, 상향조절된 단백질은 세포외 기질 상호작용, 국소 부착 및 프로스타글란딘 합성 및 조절 경로가 풍부하였다. 또한, 녹아웃 모델에서 증가된 풍부함을 가진 단백질은 세포자멸사 실행 단계 및 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)에 의한 신호 전달과 관련이 있었습니다(보충 표 4 ).

 

그림 2: 정자 형성 단백질의 발현에 대한 Ubb의 영향.

그림2

a , b 유전자 온톨로지 분석의 도트 플롯은 생물학적 과정 및 세포 구성 요소가 풍부한 하향 조절된 DEP의 결과입니다. 색상은 g:scs correction -log(adjusted p -value)를 나타내고, 원의 크기는 해당 용어의 유전자 수를 나타내며, 유전자 비율은 전체 하향 조절된 단백질 범주에 있습니다. 정자 생성과 관련된 카테고리는 빨간색으로 표시됩니다. c 하향 조절된 단백질이 풍부한 Kegg 경로, 반응체 및 Wiki 경로 기반 범주에 대한 점 플롯.

 

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정자 형성과 Ubb 관련 고환 단백질 간의 상호 작용 네트워크

유전자 온톨로지 분석은 Ubb- 녹아웃이 piRNA 대사 및 정자 형성에 필요한 단백질의 발현에 영향을 미치는 것으로 나타났다 . 정자 형성과 Ub 사이의 연관성을 조사하기 위해 STRING 데이터베이스와 Cytoscape 소프트웨어를 사용하여 Ubb 로 인코딩된 단백질(Ubb) 과 단백질 상호작용 네트워크를 구축했습니다 . LC-MS/MS 분석으로 확인된 고환 단백질 중 296개는 Ubb와 상호 작용했으며(보충 표 5 ), 그 중 24개 단백질(Psma8, Hsp90aa1, Rps6, Eef1a1, Uchl5 및 Eef2 포함)은 Ubb 결실 과 밀접하게 관련되어 있습니다 (그림 3d). . 3A). 흥미롭게도 Ubb와 상호 작용하는 24개의 DEP는 주로 RNA 결합, 세포 소기관 조직, 섬모, 생식 및 리보핵단백질 과립의 분자 기능이 풍부했습니다. 특히, Hsp90aa1, Eef1a1, Eef2 및 Eif3f는 풍부한 생물학적 과정, 정자 형성 온라인 데이터베이스 및 이전 연구의 정보를 통해 감수 세포 및 정자 세포의 성숙에 중요할 수 있음이 밝혀졌습니다 [ 18 , 25 , 26 , 27 ] (그림 3b). 단백질-단백질 상호작용 네트워크 및 프로테옴 분석에서 다음과 같은 기능적 연관성이 관찰되었습니다. 우리 결과에서 Ubb와 상호작용하는 Hsp90aa1 단백질은 결실 시 성체 마우스에서 생식 세포의 아폽토시스를 유도하고 파키텐 단계에서 성장을 억제하며 배우자를 억제합니다. 형성 [ 28 ]은 Ubb-null 모델에서 유의하게 하향 조절된 발현 수준을 보여주었고, Hsp90aa1과 상호 작용하는 piRNA 경로 구성 요소와 관련된 단백질 수준도 Ubb 제거에 의해 영향을 받았습니다(그림 3b 참조).). 우리의 결과는 또한 Ubb와 상호 작용하는 Eef2, Eef1a1 및 Eif3f의 더 넓은 역할을 암시합니다. 이들 단백질과 상호 작용이 Hspa2 Eif4g3 및 단백질의 발현 수준이 현저하기 때문에 불임의 군에서 감소 하였다하는 단백질 중 Ubb- 같은 WT 마우스 [에서 녹아웃에 비해 29 , 30 ].

 

그림 3: Ubb의 영향을 받는 단백질 네트워크 .

그림3

UBB 크게 사이의 상호 작용 때문에 붕괴의 단백질 하향 조절 UBB을 . 상호 작용 맵에서 가장자리의 두께는 결합된 점수에 비례합니다. 모든 상호 작용은 합산 점수에 기여합니다. 더 높은 점수는 더 생물학적으로 의미 있는 증거와 상관관계가 있습니다. 노드 색상 스케일은 fold-change 값을 나타내며, 유의미한 차등 발현이 없는 단백질에 대한 노드는 회색으로 표시됩니다. B Hsp90aa1, Eef1a1 및 Eef2 단백질의 네트워크의 존재에 의해 영향 UBB및 생식력과 관련된 단백질. 주황색 가장자리는 Ubb와 첫 번째 껍질 사이의 상호 작용이고 녹색 가장자리는 Hsp90aa1, Eef1 및 Eif4g3의 상호 작용 파트너를 나타냅니다. RNA 결합, piRNA 대사 과정, 섬모 및 생식 과정에 관여하는 단백질은 검은색 원과 사각형으로 표시됩니다. 이 네트워크는 cytoscape에서 STRING으로 생성되었습니다.

 

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Piwil1 및 Piwil2를 포함한 RNA 수준에서 DEP의 변경된 발현

Ubb 파괴의 영향을 받는 단백질 중 Hsp90aa1, Eef1a1, Eef2 및 Eif3f는 정자 생성과 크게 관련된 단백질 입니다. 많은 연구에서 보고된 바와 같이 4가지 단백질 모두 정자 생성 마커와 관련이 있습니다[ 16 , 18 , 24]. 특히 정자세포가 결핍되었을 때 파키텐 정지를 유발하는 TDRD 계열 단백질과 Piwil1/2의 수준은 일반적으로 하향조절되었으며, 이들 단백질은 모두 위에서 언급한 4가지 핵심 단백질과 상호작용하였다. 또한, 우리의 데이타 여러 DEPs가 세균 세포 특이 전사 인자를 포함한 특성을 DNA 결합, 그들의 유전자 발현 misregulation 안으로 감수 분열 동안 pachytene 단계에서 고환 발달 및 성장 정지의 실패에 중요 할 수있다 보여 UBB - / -쥐. 이를 테스트하기 위해 우리는 단백질체 분석 결과를 기반으로 RNA 수준에서 여러 상향 및 하향 조절된 DEP의 변경된 발현을 조사했습니다. 상향조절된 단백질은 고환 체세포에서 높게 발현되는 PDGF 신호전달과 관련된 세포외 기질 구성성분 및 단백질을 포함하고, 하향조절된 단백질은 생식 세포의 감수 분열 및 정자 생성에 필수적인 piRNA 대사 및 섬모 생성과 관련이 있다.

 

우리의 RNA 발현 수준 것으로 Piwil1 및 Piwil2 , 피르 대사에 관여하고 Dync2h1 및 Dynlrb2 ciliogenesis 관여가 크게 감소 하였다 UBB - / - 고환. (도 4A ). 그러나 WT와 Ubb -/- 고환 사이에 Col6a1 및 Thbs3을 포함한 PDGF 신호 전달에 관여하는 세포외 기질 구성성분 및 단백질의 발현 수준에는 유의한 차이가 없었다 (도 4b).). 그들의 발현은 단백질 수준에서만 증가했는데, 이는 아마도 고환 체세포 수의 상대적인 증가와 Ubb -/- 고환 및 직접적인 생식 세포 수의 감소에 의한 조직의 세포 구성 비율의 차이 때문일 것입니다. Ub 결핍으로 인한 단백질 수준의 잘못된 조절. 실제로 Ubb -/- 고환 에서 상향조절되는 단백질 중 하나 인 Tubb2a 의 발현도 섬모 형성에 관여하지만 RNA 수준에서 약간 증가하지만 유의하게 증가하지는 않는 것으로 확인되었다(Fig. 4c).). 전반적으로, 우리의 qRT-PCR 결과는 발달 중인 고환의 생식 세포에서 많이 발현되는 Piwil1 및 Piwil2의 발현이 Ubb -/- 고환 에서 단백질 수준뿐만 아니라 RNA 수준에서도 유의하게 감소 되었음을 시사한다 . 마우스 Piwi 단백질 패밀리 중 Piwil1은 정자 형성 후기 단계에서 분화하는 정자에서만 발현되는 반면, Piwil2는 정자 형성 전반에 걸쳐 발현된다[ 31 ]. 따라서,이 발현 감소 Piwil2을 의 앞에 수 Piwil1을 의 정자 중 UBB - / -고환. Piwil1/2와 대조적으로, 고환 체세포(예: Sertoli 세포 및 Leydig 세포)에서 상대적으로 높게 발현되는 PDGF 신호전달 단백질 및 세포외 기질 성분은 Ubb -/- 고환 에서 단백질 수준에서만 증가하였다 .

 

그림 4: 고환 DEP의 변경된 유전자 발현.

그림4

단백질체 분석에 기초하여 Ubb +/+ (WT) 및 Ubb -/- 고환 의 여러 mRNA 수준을 qRT-PCR을 사용하여 결정했습니다. a 하향조절된 단백질 중 piRNA 대사 과정에 관여하는 유전자( Piwil1 , Piwil2 , Piwil4 ) 및 섬모 조립( Dync2h1 및 Dynlrb2 )에 관여하는 유전자의 발현 수준을 Ubb +/+ 및 Ubb -/- 고환(  각각 n = 3 ). b upexpressed 단백질 중 PDGF 신호 전달에 관여하는 유전자의 발현 수준 ( Col6a1 ,Col6a2 및 Thbs3 )은 Ubb +/+ 및 Ubb -/- 고환 사이에서 비교되었습니다 (  각각 n = 3). c 섬모 조립에 관여하는 Tubb2a 의 발현 수준은 WT 고환에 비해 Ubb -/- 고환 에서 증가했습니다 (  각각 n = 3). 사용된 모든 mRNA는 Ubb +/+ 또는 Ubb -/- 고환에서 분리되었으며, 이는 출생 후 20일(P20)에 마우스에서 수집되었습니다. 유전자의 모든 발현 수준은 Gapdh 수준 으로 정규화 되었으며 데이터는 표시된 샘플 수의 평균 ± SEM으로 표시됩니다. *P  < 0.05; ** P  < 0.01 대 Ubb +/+ . NS는 중요하지 않습니다.

 

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의 증가 표현 UBB는 출생 후 Piwil2 수준의 상향 조절에 필수적이다

우리는 섬모 형성에 필수적인 단백질(Dync2h1 및 Dynlrb2와 같은)뿐만 아니라 늦게 발현되는 Piwi 단백질, 특히 Piwil1의 수준이 Ubb -/- 고환 에서 감소 한다는 것을 발견했습니다 . 때문에 UBB -null 정조 세포가 pachytene 구속으로 인해 감수로 진행할 수 없다 [ 20 ], 이들은 정자 형성의 후기 단계에서 증가 해야하는 P20에서 이들 단백질의 수준을 하향 조절 사이 고환 생식 세포의 개체군으로부터 발생할 수도 WT 및 Ubb -/- 고환. 또한 Ubb가 고환 생식 세포에서 적절한 감수 분열 단계를 통과하기 위해 Piwil2를 포함한 중요한 단백질 수준의 상향 조절에 발현이 필요합니다.

 

이 문제를 조사하기 위해, 우리는 WT와의 성선 능선 고립 Ubb- 14.5 DPC에 널 (null) 남성 배아와의 RNA 발현 수준을 분석 Piwil2 및 Piwil4을 . 이 기간 동안 Piwil1 은 발현되지 않았고 Piwil2 는 P20보다 낮은 수준으로 발현되었으며 Piwil4 는 발달 중인 배아 생식선에서 높게 발현되었다[ 31 ]. 우리는 Piwil2 와 Piwil4 의 발현 수준이 WT와 Ubb -/- 생식선 융기 사이에서 유의하게 다르지 않다는 것을 발견했습니다 (그림 5a ). 흥미롭게도 Piwil4 의 표현 수준뿐만 아니라높은 출생 통해 초기 배아 발달에서 발현되는, 또한 그 Piwil2 에도 불구하고, 변경되지 않았 UBB의 중단 (도. 5A ). 또한, 우리는 Ubb 및 Piwil2 발현이 배아 생식선 융기부에서와 비교하여 P20 고환에서 유의하게 상향 조절됨을 관찰했습니다 (그림 5b, c ). 이 관찰과 우리의 proteomic 데이터는 Ubb -/- 수컷 마우스 의 불임 표현형이 E14.5와 P20 사이의 고환 발달 동안 Piwil2 발현의 잘못된 조절 또는 극적인 상향 조절의 부족으로 인해 발생할 가능성을 제기했습니다 (그림 5c ). 사실로,Piwil2- 녹아웃 마우스는 정자 형성 동안 파키텐-체포 표현형을 나타내기도 했습니다[ 32 ]. 흥미롭게도 Piwil4 발현은 유전형에 관계없이 고환 발달 동안 하향 조절되었습니다(그림 5d ). 이러한 결과와 proteomic 데이터를 기반으로 우리는 Piwi family 및 piRNA 대사에서 단백질 수준의 상향 조절을 통해 감수 분열 진행 및 생식 세포 수 증가를 위해 출생 후 고환 발달 동안 Ubb 발현의 상향 조절 이 필요 하다고 제안합니다 .

 

도 5: 배아 발달과 비교하여 출생 후 발달에서 Ubb 및 Piwi l2 의 증가된 발현 수준 .

그림 5

로부터 단리 된 mRNA 사용 UBB + / + (WT) 및 UBB - - / 생식선 리지 ( N  의 mRNA 수준 배아 발달 (E14.5)의 14.5 일에서 = 3 각) Piwil2 및 Piwil4가 QRT-PCR 등을 사용하여 측정을 Gapdh 수준으로 정규화되었습니다 . b E14.5 및 P20 Ubb +/+ 고환 의 Ubb 발현 수준 (  각각 n = 3)은 qRT-PCR을 사용하여 결정하고 Gapdh 수준으로 정규화했습니다 . c , d E14.5 생식선 융기선과 P20 고환 사이의 mRNA 수준의 상대적 비교를 위해 측정된 수준Piwil2 및 Piwil4 발현 UBB + / + 및 UBB - / - 고환 ( N  = 3 각각) E14.5에서 WT에 해당 폴드 변경 상대적으로 표시 하였다. 데이터는 표시된 샘플 수의 평균 ± SEM으로 표시됩니다. ** P  < 0.01; *** E14.5에서 P  < 0.001 대 Ubb +/+ . NS, 중요하지 않습니다.

 

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논의

마우스의 폴리유비퀴틴 유전자는 거의 모든 세포 유형과 평생 동안 고도로 발현됩니다. 세포가 산화 스트레스와 같은 특정 환경 자극을 만나면 이러한 유전자는 쉽게 이용 가능한 유리 Ub를 보충하기 위해 추가로 상향 조절됩니다. 배아 발달과 같은 복잡하고 정교한 과정에서도 폴리유비퀴틴 유전자의 발현은 줄기 세포의 분화와 조직 발달에 필수적입니다. 우리는 이전에 폴리유비퀴틴 유전자 Ubb- 녹아웃 마우스 의 직선 표현형이 수컷 및 암컷 마우스 모두에서 시상하부 신경변성 및 불임 임을 보고했습니다 . 마우스의 두 polyubiquitin 유전자의 발현 수준 UBB는 보다 상대적으로 높은 UBC고환의 생식 세포에서; 따라서 Ub 결핍은 감수 분열 진행 동안 파키텐 단계에서 치명적인 결함을 유발합니다.

 

여기에서 우리는 WT와 Ubb 의 프로테옴을 조사했습니다.P20의 녹아웃 고환은 발달 과정에서 DEP와 그 기능을 분석합니다. 세포에서 Ub의 일반적인 기능은 단백질의 분해 및 품질 관리이기 때문에 상당한 수의 단백질 수준이 Ub 결핍 고환에서 상향 조절되어야 한다는 우리의 추측과 달리 562개의 단백질만 유의하게 차등적으로 발현되었습니다. 우리는 또한 piRNA 대사 및 정자 형성에 관여하는 상당한 수의 단백질(287)의 하향 조절된 수준을 발견했습니다. 단백질-단백질 상호작용 지도가 생성되었을 때 Ubb는 267개 단백질과 상호작용했으며 그 중 22개 단백질 수준이 하향 조절되었음을 보여주었습니다. 하향 조절된 수준의 단백질 중에서 Hsp90aa1, Eef2, Eef1a1 및 Eif3f가 중요하며 정자 생성에서 다른 역할을 합니다.

 

이전에 보고된 바와 같이, Hsp90aa1의 결실은 성체 마우스에서 생식 세포의 아폽토시스를 유도하고, 파키텐 단계에서 성장을 정지시키고, 배우자 형성을 억제합니다[ 28 , 33 ]. 또한, Hsp90aa1은 인산화 조절 및 Piwil로의 piRNA 로딩을 통해 Piwil의 생합성과 관련이 있습니다[ 25 , 28 ]. 우리의 결과에서, Ubb와 상호작용하는 Hsp90aa1 단백질은 Ubb -null 모델 에서 유의하게 하향조절된 발현 수준을 나타내 었고, HSP90aa1과 상호작용하는 piRNA 경로 구성요소와 관련된 단백질 수준도 Ubb 제거에 의해 영향을 받았다 (도 3b 참조 ). 도 3b에 도시된 바와 같이, Hsp90aa1은 piRNA 생성에 관여하는 Piwil1/2, 정자 운동성과 관련된 Ddx4, 정상 정자 형성에 필요한 Tdrd family 단백질과 같은 piRNA 경로 성분과 높은 결합 점수로 밀접하게 상호작용했다. Piwil1/2 외에도 Tdrd1, Tdrd9 및 Hspa2가 Hsp90aa1 단백질과 상호작용했습니다. 이 단백질은 생식 세포가 후기 정자 세포와 정자로 성숙하는 데 필수적인 것으로 알려져 있으며 Ubb -/- 모델에서 그 수준이 현저히 감소했습니다 [ 29 , 34 , 35 ] (보충 표 3 ). 반대로 정상 파키텐 세포에서 많이 발현되어 Piwil 단백질의 구조를 안정화시키는 Mov10l의 수치는 [36 , 37 ] 및 Piwi 단백질의 재활용을 촉진하는 Fkbp6 은 Ubb 결실 모델 에서 크게 다르지 않았다 (보충 표 2 참조 ).

 

우리의 결과는 또한 Ubb와 상호 작용하는 Eef2, Eef1a1 및 Eif3f의 더 넓은 역할을 암시합니다. Eef2 및 Eef1a1은 Ubb와 상호 작용하고 발현에 상당한 차이를 보이며 염색질체(CB)라고 하는 생식 세포 특이적 핵주위 구조 중 하나에서 Upf1과 연관됩니다[ 38 , 39 , 40 ]. 또한, Rpl10l은 정자 형성에 필수적이며 그 수준은 Ubb -/- 모델 에서 하향 조절되었습니다 . Rpl10l은 고환-특이성 레트로유전자이며 정자세포에서 의기(prophase)에서 중기(감수분열 I)로 전환할 때 필수 단백질입니다. [ 41]. Eef1a1, Eef2 및 Eif3f 모두와 관련된 Rpl10l의 수준은 정자 세포에서 의기에서 중기로의 전환을 영속화하고 Ubb -/- 모델 에서 하향 조절된 60초 및 40초 리보솜 단백질과 상호 작용 합니다. Rpl3/4/6 단백질은 또한 파키텐 단계에서 정자 생성 mRNA의 번역 활성화를 조절하는 Pabpc1 단백질과 상호작용하는 것으로 나타났습니다[ 42 ](그림 3a 참조 ). 또한, Eef1a1은 Tdrd1과 상호작용하는데, 이것은 Tudor family의 Piwil2에 결합하여 piRNA 경로에서 단백질-단백질 상호작용에 대한 piRNA 매개체 또는 보조인자의 인식을 조절합니다[ 34 , 43 , 44]. Eef1a1, Eef2 및 Hsp90aa1은 일반적으로 정자 생성 및 정자 발달에 필수적인 단백질인 Hspa2와 관련이 있습니다[ 45 ]. Hspa2는 Cdk1과 상호작용하고 정자 세포에서 Cdk1/cyclin B1 복합체 형성에 필수적인 역할을 합니다. 따라서 Hspa2의 결핍은 감수 분열 I 동안 파키텐 정자 세포의 단계 정지를 나타냅니다[ 29 ].

 

Eif3f는 CB [튜더 도메인 패밀리 단백질의 Piwi에 / Eif3f / Elavl1 supercomplex 그 조절 mRNA의 번역의 구성 단백질의 하나 인 42 , 46 , 47 UBB 포함] 및 방송 상호 작용하지만, 독립적 인 UBB의 삭제 [ 27 ]. 한편 Elavl1, Eif3f와 상호 작용도의 삭제에 의해 그 발현 량 변화가 없었다 UBB을 하지만 Elavl1와 supercomplex 형성 Eif4g3 Pabpc1 및 단백질의 발현에 의해 영향을 받았다 UBB . Eif4g3은 Hspa2의 번역에서 기능하고 남성 생식 세포에 필요합니다 [ 30 , 48]. Eif4g3의 삭제는 Hspa2 번역에 영향을 미치고 감수 분열 단계에서 정자 형성을 억제하여 불임을 초래합니다[ 30 ]. Pabpc1은 pachytene 및 round-spermatid(RS) 단계에서 가장 높은 발현 수준을 보였고, 그 결핍은 불임을 유발할 수 있다[ 42 ]. 따라서, 우리의 결과는 Ubb- 넉아웃으로 인해 불임을 유발하는 WT 마우스와 비교하여 Pabpc1 단백질 수준의 유의한 감소를 보여주었으며 , 이는 발현 수준의 감소가 다른 단백질 수준의 변화와 함께 불임을 유발할 수 있음을 시사합니다. 또한, Pabpc1은 Dazl mRNA의 폴리 A 꼬리와 상호 작용하여 정자와 정자, 감수분열 단계에서 성숙에 필요한 단백질의 번역 조절자 역할을 합니다[ 16].

 

경로와 관련하여 PDGF 및 세포외 기질 관련 단백질의 발현은 Ubb- 녹아웃이 고환 크기의 감소를 야기하기 때문에 상이한 수의 세포에 연결될 수 있는 단백질 수준에서만 상이하였다 . 그러나, piRNA 대사 및 섬모형성 관련 유전자의 발현은 전사체 수준에서 하향조절되었다. 이것은 piRNA 대사 및 섬모형성에 관여하는 단백질의 전사를 조절하는 단백질 수준의 변경을 강조합니다. Piwi 단백질은 주로 게놈 유지 및 다양한 표적 유전자의 발현 조절에 관여합니다[ 47 ]. Piwil2 발현은 RNA 및 단백질 수준 모두에서 하향조절되는 것으로 밝혀졌다. 이것은 Ubb 의 그럴듯한 역할을 나타냅니다.- Piwil2의 전사 조절에서 매개된 단백질. 요약하면, 이 연구는 Ubb -/- 고환 의 프로테옴을 제공하고 Ubb 녹아웃 매개 불임에 대한 메커니즘을 제공했습니다 . 또한 정자 형성 및 고환 성장에서 Piwi 관련 단백질의 감사하지 않은 역할을 강조합니다.

 

재료 및 방법

쥐

마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 플라스틱 케이지에서 유지되었습니다 . Ubb +/+ 및 Ubb -/- 마우스는 Ubb +/- 마우스 의 교배로부터 얻었다 . 모든 실험은 서울대학교 동물병원 동물관리위원회(UOS IACUC)에서 승인한 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 UOS IACUC(UOS-170517-1, UOS IACUC-2020-03-A)의 승인을 받았습니다.

 

Ub +/+ 및 Ubb -/- 마우스 에서 분리된 고환 및 배아 남성 생식선

고환은 출생 후 20일(P20)에 Ubb +/+ (WT) 및 Ubb -/- 마우스로부터 분리되었고 다른 인접 조직을 제거하기 위해 차가운 ​​PBS에 넣었습니다. 교배 후 14.5일째에 WT 및 Ubb -/- 마우스 로부터 배아 수컷 생식선을 절개 현미경으로 분리하고 차가운 PBS에 넣어 다른 배아 조직을 제거했습니다. 분리 후 P20 고환과 E14.5 남성 생식선을 즉시 액체 질소에서 동결하고 추가 실험을 위해 -80°C에 보관했습니다.

 

단백질 추출 및 트립신 소화

좌측 고환 조직을 Cryoprep 장치(CP02; Covaris, USA)를 사용하여 개별적으로 동결 분쇄하였다. 각 조직 조각을 드라이아이스 위의 cryovial(430487; Covaris, USA)에 넣고 Covaris 티슈 백(TT1; Covaris, USA)으로 옮기고 액체 질소에 넣은 후 충격 수준 3으로 30초 동안 분쇄하였다. 그런 다음 각 조직의 분말을 초음파 처리 튜브(002109; Covaris, USA)에 넣고 600μL의 용해 완충액(RIPA 완충액[89900; Thermo Fisher Scientific, USA], 534μL; 100 × Halt™ Protease Inhibitor Cocktail [78430; Thermo Fisher Scientific, USA], 6 μL, 10 × PhosSTOP™ [4906845001; Roche, Swiss], 60 μL). 조직 용해는 5초 동안 2W(강도 5), 20초 동안 36W(강도 10) 및 0W(강도 0)의 설정에서 집속된 초음파 발생기(S220; Covaris, USA)를 사용하여 초음파 처리하여 수행되었습니다. 10초 초음파 처리 주기는 16°C에서 20회 반복되었습니다. 균질물을 16,000 x에서 원심분리했습니다. g 를 4°C에서 10분간 유지하고 상층액을 새 튜브로 옮겼습니다. 단백질 농도는 Pierce™ BCA 단백질 분석 키트(23227; Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 측정되었습니다. Suspension-Trapping(S-Trap) 필터(C02-mini-80; Protifi, USA) 방법을 사용하여 각 80μg의 단백질을 개별적으로 분해했습니다. [ 49]. 각 샘플의 단백질을 5% sodium dodecyl sulfate(SDS) 및 20mM 1,4-dithiothreitol(10708984001; Roche, Swiss)로 변성 및 환원시키고 95°C에서 10분간 끓인 다음 40°C로 알킬화합니다. mM 요오도아세트아미드(IAA)(I16125-10g; Sigma-Aldrich, USA)를 어둠 속에서 실온(RT)에서 30분 동안. 다음으로, 최종 농도의 1.2% 인산(695017-100ML; Sigma-Aldrich, USA)과 6부피의 결합 완충액(90% 메탄올 및 100mM 트리에틸 암모늄 중탄산염)을 샘플에 첨가하고 부드럽게 혼합하여 콜로이드를 형성했습니다. 단백질 입자. 콜로이드성 단백질 용액을 S-Trap 필터에 로딩하고 4,000 x g에서 30초 동안 회전시켰고, 통과액을 수집하여 필터에 다시 로딩하였다. 그런 다음 필터를 400μL의 결합 완충액으로 2~3회 세척했습니다. 7개의 샘플을 1:20 효소 대 기질 비율에서 Pierce™ Trypsin Protease(90057; Thermo Fisher Scientific, USA)로 분해하고 37°C에서 밤새 인큐베이션했습니다. 펩티드는 3가지 단계적 완충액으로 용리되었다: (1) 80μL의 50mM 트리에틸암모늄 바이카보네이트(TEAB)(90114; Thermo Fisher Scientific, USA), (2) 80μL의 0.2% 포름산(56302-50ML, Fluka, 미국) H2 O 및 (3) 50% 아세토니트릴 및 0.2% 포름산 80μL, 4000 x g 에서 30초 동안 원심분리  . 생성된 트립신 펩타이드를 Speed-Vac(Hypercool, Labex, Korea)를 사용하여 건조하고 tandem mass isobaric tag(TMT)(A44520; Thermo Fisher Scientific, USA) 표지까지 -80°C에서 유지하였다.

 

펩타이드의 TMT 라벨링 및 염기성 pH 역상 분획

펩타이드는 다음과 같이 Tandem Mass Tag(TMT) 시약(90111; Thermo Fisher Scientific, USA) 중에서 7개의 다른 질량 태그로 라벨링되었습니다. 및 128 N TMT 시약, Ubb 의 3가지 펩티드 ​​샘플 -/-고환 조직은 128C, 129C 및 130N TMT 시약으로 표지되었습니다. 제조된 TMT 시약을 펩티드 샘플로 옮기고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 짧은 볼텍싱을 수행하였다. 반응을 5% 히드록실아민으로 켄칭하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 배치의 모든 TMT-표지된 펩티드를 풀링하고 진공 원심분리에 의해 농축하였다. 표지된 펩타이드를 분획을 위해 분석 컬럼(XBridge Peptide BEH C18 Column; 300 Å, 5 µm, 4.6 x 250 mm, 186003625; Waters™, USA)에 로딩했습니다. 구배는 용매 A(2%[vol/vol] 아세토니트릴 중 4.5mM 암모늄 포르메이트[17843-50G; Fluka, USA][pH 10])로 작동되는 Ultimate 3000 HPLC 시스템(Dionex, USA)을 사용하여 생성되었습니다. 및 용매 B(90% [vol/vol] 아세토니트릴 중 4.5mM 포름산암모늄 [pH 10]). 구배는 다음과 같았다: 0-7분, 0% B; 7-13분, 16% B; 13-73분, 40% B; 73-77분, 44% B; 77-82분, 60% B; 82-96분, 60% B; 96–110분, 0% B [50 ]. 분리된 펩티드를 1분마다 96개의 튜브에 수집하고 8개의 부분을 결합하여 12개의 분획으로 비연속적으로 풀링하였다. 생성된 12개의 분획을 Pierce C18 스핀 컬럼(89870; Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 탈염하였다(도 1a ).

 

글로벌 프로테옴에 대한 LC-MS/MS 분석

LC-MS 분석을 위해 nanoACQUITY UPLC 시스템(Waters™, USA)을 Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer(Thermo Fisher Scientific, Germany)에 연결하고 트랩 컬럼(Acclaim™ PepMap™ 100 C18 LC Column)을 장착했습니다. , C18, 75 μm × 2 cm, 5 μm, 164564, Thermo Fisher Scientific, USA) 정제 후 분석 컬럼(EASY-Spray™ LC Columns, C18, 75 μm × 50 cm, 2 μm, ES803A, Thermo Fisher 사이언티픽, 미국). 펩티드는 용매 A(물 중 0.1% 포름산 및 2% 아세토니트릴) 및 용매 B(90% 아세토니트릴 중 0.1% 포름산)를 포함하는 이동상을 사용하여 분리되었습니다. global proteome-digested peptide의 경우 100% solvent A를 사용하여 3 μL/min의 유속으로 4분간 표지된 펩타이드를 트랩하고, 최적화된 linear-gradient elution program은 다음과 같이 설정하였다. ): 0:3, 4:3, 7:12, 143:40, 144:80, 154:80, 155:5 및 180:5. 유속은 실행 시간 동안 300nL/min이었습니다. 전체 MS 스캔은 MS1 수준에서 70,000의 분해능과 1e6의 자동 이득 제어(AGC) 목표에서 350–1,800 m/z의 질량 범위에 대해 획득되었으며 MS/MS 분석은 긍정적인 데이터 종속 획득에 의해 수행되었습니다. 방법. 전기분무 이온화의 전위는 2.2kV로 설정되었고 모세관의 온도는 250℃로 설정되었다. MS1 스캔에서 상위 12개 전구체 피크를 선택하고 단편화를 위해 분리했습니다. 고에너지 충돌 해리(HCD)를 사용한 MS2 획득의 경우, 고정된 첫 번째 m/z 100m/z, AGC 타겟 1e6, 격리 창 2.0m/z, 격리 오프셋을 사용하여 해상도를 35,000으로 설정했습니다. 0.5 m/z 및 32%의 정규화된 충돌 에너지(NCE). 할당되지 않음, 1 또는 >의 청구 상태

 

글로벌 프로테옴 데이터의 단백질 데이터베이스 검색 및 정량화

MS/MS 스펙트럼은 Sequest HT 검색 엔진을 사용하여 Uniprot Mus musculus 참조 의 합성 데이터베이스 (2020년 5월, 21,989개 항목)에 대해 검색되었습니다. 검색은 최대 2개의 누락된 절단 부위를 허용하는 완전한 트립신성 펩티드로 제한되었습니다. 변형에서 카바미도메틸화, 시스테인에서 이황화 결합의 알킬화(+57.021 Da), 라이신의 TMT 변형 및 N-종결(+229.163 Da)이 정적 변형으로 기록되었습니다. 메티오닌의 산화(+15.995 Da)를 가변 변형으로 사용했습니다. Proteome Discoverer 2.4(Thermo Fisher Scientific, USA)의 "peptide and protein quantifier" 방법을 사용하여 위양성 데이터를 제거하고 각 리포터 이온을 정량화하기 위해 펩티드 수준에 대한 FDR(False-discovery Rate)을 0.01로 설정했습니다.

 

RNA 분리 및 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응

정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)은 이전에 설명된 대로 약간 수정하여 수행되었습니다[ 11 ]. 간략하게, 제조사의 프로토콜에 따라 Tri-reagent(Molecular Research Center, USA)를 사용하여 세포로부터 total RNA를 분리하고 SuperScript reverse transcriptase(Enzynomics, Republic of Korea)를 사용하여 10ng의 total RNA를 역전사를 위한 주형으로 사용하였다. oligo-dT (Cosmogenetech, 대한민국). qRT-PCR에는 SYBR-Green qPCR Mastermix(Enzynomics, 대한민국)와 iCycler 시스템(Bio-Rad, USA)을 사용했습니다. 포함하여 표적 유전자의 mRNA 발현 수준 UBB , Piwil1 , Piwil2 , Piwil4 , Dync2h1 ,Dynlrb2 및 Thbs3 은 Gapdh 수준 으로 정규화되었습니다 . qRT-PCR에 사용되는 프라이머의 서열은 보충 표 S1에 나열되어 있습니다.

 

통계 분석 및 유전자 농축 분석

확인된 모든 단백질의 농축 경로 분석을 위해 양측 스튜던트 t-검정에서 발현 변화가 ±1.2배 이상인 단백질을 p-값이 0.05 미만인 차등 발현 단백질(DEP)로 분류했습니다. 크게 상향 조절되거나 하향 조절된 DEP에 대해 주석 강화 프로세스가 수행되었습니다. 유전자 온톨로지(GO) 검색은 g:Profiler를 사용하여 Ubb- 넉아웃에 의해 영향을 받는 생물학적 과정과 세포 성분을 탐색하기 위해 수행되었습니다 [ 51 ]. DEP에 의해 강화된 GO 생물학적 과정은 FDR < 0.05인 것으로 밝혀졌습니다. DEP에 대한 네트워크 모델을 재구성하기 위해 STRING v11.0 공개 데이터베이스 [ 52]. 네트워크 모델은 향상된 프로세스 및 상호 작용 데이터를 묘사하기 위해 Cytoscape를 사용했습니다