활동성 COVID-19 감염 진단을 위한 울트라포터블

활동성 COVID-19 감염 진단을 위한 울트라포터블

자급식 현장 진료 핵산 증폭 검사

 

현재 현장 진료 환경에서 질병의 발병을 감지할 수 있는 신속한 COVID-19 검사에 대한 수요가 높습니다. 우리는 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 원리를 기반으로 활동성 COVID-19 감염 진단을 위한 울트라포터블, 자급식, 현장 진료 핵산 증폭 테스트를 개발했습니다. LAMP 분석은 100% 민감하고 특이적이며 최소 300개의 RNA 사본/SARS-CoV-2 반응을 감지합니다. 필요한 모든 샘플 운송, 용해 및 증폭 단계는 배터리로 작동되는 포켓 크기(6x9x4cm 3 )로 제어되는 독립형 일회용 카트리지에서 수행됩니다.) 단위. 테스트는 작동하기 쉽고 숙련된 인력이 필요하지 않습니다. 샘플에서 답변까지의 총 시간은 약 35분입니다. 비색 판독값은 긍정적 또는 부정적 결과를 나타냅니다. 이 휴대용 진단 플랫폼은 커뮤니티 환경에서 빠르고 효과적인 테스트를 위한 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 효과적인 분류와 시기적절한 치료 및 감염 통제 개입 측면에서 임상 의사 결정을 가속화할 것입니다.

 

소개

신종 코로나바이러스 감염증 2019(COVID-19)로 인해 전 세계적인 대유행이 발생했습니다. 이를 일으키는 바이러스는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)입니다. 이것은 주로 밀접 접촉과 호흡기 비말을 통해 사람들 사이에 전파되는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스입니다. 바이러스 검사, 접촉 추적 및 격리는 바이러스 확산을 제한하기 위해 널리 사용되는 공중 보건 전략입니다 1 . 현재 COVID-19 테스트에 대한 수요가 많습니다. 이 글을 쓰는 시점에서 활성 COVID-19 감염에 대한 2백만 개 이상의 테스트가 미국에서 매일 수행되고 있습니다 2 . 백신을 사용할 수 있는 경우에도 공중 보건 감시를 위해 높은 수준의 테스트가 계속될 가능성이 있습니다. 3 , 4. 따라서 현재의 테스트 표준 5 에 추가하여 COVID-19 테스트를 위해 저렴하고 사용하기 쉬운 또는 휴대용 기술을 갖는 것이 중요합니다 . 실제로 WHO 전문가 그룹은 COVID-19 발병 6 에 대응하여 8가지 연구 우선 순위 중 첫 번째로 검사를 확인했습니다 . 현장 진료 테스트(POCT)는 임상 의사 결정을 가속화하고 효과적인 분류와 시기 적절한 치료 및 감염 통제 개입을 가능하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다 7 . 이것은 과부하된 중앙 실험실에 대한 압력을 완화하고 커뮤니티 환경에서 테스트를 허용합니다.

 

현재 COVID-19에 대한 검사는 혈청 기반 항체 검사와 분자 검사의 두 가지 주요 유형이 있습니다. 항체 검사는 감염의 결과로 사람이 생산하는 말초혈액에서 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체(IgM 및/또는 IgG)의 존재를 감지합니다. 따라서 이러한 검사는 활성 감염 8을 정확하게 나타내지 않습니다 . 이에 비해 분자 검사는 개인에게서 채취한 검체에서 바이러스 물질을 직접 검출하여 활성 감염을 나타냅니다. 일부 분자 검사는 바이러스의 특정 단백질을 검출하고 항원 검사로 알려져 있지만 대부분의 분자 검사는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 루프 매개 등온 증폭(LAMP)을 사용하는 핵산 증폭(핵산 증폭 검사, NAAT)을 기반으로 합니다. 9. 항원 검사는 신속한 진단이 가능하지만 일반적으로 NAAT 10 , 11 , 12에 비해 민감도가 낮습니다 . SARS-CoV-2 바이러스 테스트의 현재 표준은 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 13으로 알려진 실험실 기반 NAAT 입니다. 이 검사는 전문 병리학 실험실에서 비교적 전문화된 고가의 장비(qPCR 기계)를 사용하여 수행됩니다.

 

LAMP는 비교적 빠르고 작동이 간단하며 간단한 장비가 필요하기 때문에 NAAT POCT 개발에 적합한 후보입니다. LAMP는 바이러스 RNA의 8개 영역을 식별하는 6개의 프라이머를 사용합니다. 반응은 단일 온도 14에서 진행 됩니다. 현재까지 FDA는 COVID-19 진단을 위해 173개의 NAAT를 승인했으며 그 중 6개는 LAMP 기반 15 입니다. PCR 기반 테스트에 비해 LAMP 기반 테스트의 주요 이점은 샘플에서 결과까지의 시간이 더 짧다는 것입니다. 그러나 실제 테스트 시간은 샘플 용해 및 준비 단계에 소요된 시간을 포함하여 보고된 것보다 더 길어질 수 있습니다. 현재 이러한 LAMP 기반 검사의 하나를 제외한 모든 검출 또는 샘플 용균 대형, 비 - 휴대용 수반 장비의 사용이 필요 16. 따라서 이러한 테스트의 대부분은 전문 실험실 장비의 요구 사항, 고도로 훈련된 개인이 작동하는 별도의 RNA 추출 단계 및 대형 벤치탑 판독 장치의 요구 사항이 궁극적으로 현장 진료 환경에서의 사용을 제한하기 때문에 거의 POCT NAAT입니다. 빠르고 간단하며 휴대가 간편하고 최소한의 훈련을 받은 개인이 운영할 수 있는 현장 진료 NAAT가 시급히 필요합니다.

 

여기에서는 역전사(RT)-LAMP 증폭을 기반으로 하는 이러한 테스트의 프로토타입을 설명합니다. 독립형 장치를 사용하여 수행되며 특수 실험실 기기, 별도의 RNA 추출 단계 또는 대형 벤치탑 판독 장치가 필요하지 않습니다. 대신 희석된 시료를 끓여서 일회용 카트리지에 RNA 추출을 통합하도록 설계되었습니다. 이 방법은 다른 바이러스 표적의 검출을 위해 구강인두 면봉 샘플에서 RNA를 추출하는 데 효과적인 것으로 나타났습니다 17. 이 포켓 사이즈 장치는 휴대가 간편하고 작동이 간편하며 배터리나 보조 배터리를 사용하여 실행할 수 있습니다. 결과 시간까지의 직접 샘플은 약 35분입니다. 비인두 면봉이 완전히 밀봉된 일회용 카트리지에 직접 로드되어 표준 실험실 설정 외부에서 안전한 테스트가 가능하므로 추가 샘플 전송 단계가 필요하지 않습니다. 이 장치는 LAMP 프라이머를 변경하기만 하면 다른 호흡기 바이러스를 검사할 수 있습니다.

 

결과 및 토론

디자인 개요

일회용 시료 채취 관, 일회용 카트리지, 및 재사용 가능한 제어 유닛 (도. : 상기 장치는 3 개 가지 주요 구성 요소를 포함 1 A)를.

 

그림 1

그림1

장치의 전체 디자인. ( A ) 실제 장치의 사진과 수집 튜브, 일회용 카트리지 및 재사용 가능한 제어 장치를 포함하는 다양한 구성 요소의 렌더링된 이미지. ( B ) 챔버 2의 결과 판독값. 분홍색은 음성을 나타내고 노란색은 양성 결과를 나타냅니다.

 

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테스트를 수행하기 위해 비인두 면봉 또는 타액 샘플을 수집하여 탈이온수(DI)가 들어 있는 수집 튜브 안에 넣습니다. 그런 다음 튜브를 샘플 용해/RNA 추출을 위한 용해 챔버(챔버 1)와 LAMP 반응을 위한 사전 로드된 반응 챔버(챔버 2)가 있는 카트리지에 나사로 고정합니다. 재사용 가능한 제어 장치에는 카트리지의 챔버에서 RNA 추출 및 LAMP 반응을 위한 가열 온도와 시간을 제어하는 ​​가열 패드가 포함되어 있습니다.

 

샘플을 챔버 1로 가져와 95°C에서 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 LAMP 마스터믹스가 포함된 챔버 2로 이동하고 30분 동안 60°C로 가열됩니다. SARS-COV-2 바이러스의 존재 옐로우 (.도 2에서 변화 핑크 챔버 내의 시약의 색으로 한 B). 대조적으로, 샘플에 SARS-CoV-2가 포함되지 않은 경우 시약의 색상은 분홍색으로 유지됩니다.

 

SARS-CoV-2 LAMP 분석

우리는 LAMP 분석 네 가지 세트는 N 개의 유전자 표적 및 나머지 두는 E 유전자 (도. 타겟팅 설계된 2 A)를. 서열 정렬은 모든 4개 세트가 공개적으로 이용 가능한 SARS-CoV-2 서열(GenBank: MN908947.3)과 일치하고 표준 SAR-CoV 2 균주와 영국 변이체(B.1.1 0.7, 돌연변이 외부 프라이머 영역) (도. 2 A) 18 .

 

그림 2

그림2

LAMP 분석 설계 및 검증. ( A ) LAMP 분석의 프라이머 서열. ( B ) 분석의 검출 한계. ( C ) NATtrolTM Respiratory Panel 2(RP2) 컨트롤을 사용한 교차 반응성 검증. 분홍색 반응은 부정적인 결과를 나타내고 노란색은 긍정적인 결과를 나타냅니다. 빈 샘플에는 뉴클레아제가 없는 물을 사용했습니다.

 

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이러한 분석의 검출 한계(LOD)는 SARS-CoV-2의 E 유전자와 N 유전자 서열을 모두 포함하는 대조군 RNA를 사용하여 처음 설정되었습니다. 최상의 성능을 제공하는 분석이 이후에 장치에 사용되었습니다. LOD는 미국 식품의약국(FDA) 지침(응급 진단)에 따라 결정되었으며 20개 중 19개 이상이 양성인 바이러스 검출의 최저 농도로 정의되었습니다 19 .

 

양성 반응은 시약을 분홍색에서 노란색으로 바꾸는 반면 음성 반응은 분홍색으로 유지되는 비색 LAMP 마스터믹스를 사용하여 LAMP 반응을 수행했습니다. LOD는 두 단계로 결정되었습니다. 첫 번째 단계에서 LAMP 반응은 반응당 RNA 300개, 100개 또는 0개 농도의 스파이크 RNA 대조군을 사용하여 4가지 모든 분석 세트에서 3중으로 수행되었습니다. 도에 도시한다. (2)B, 4개의 분석 세트 모두 반응당 300개의 스파이크된 SARS-CoV-2 RNA 사본을 감지할 수 있었지만 2개의 세트(분석 1, 분석 2)만 반응당 100개의 사본을 감지할 수 있었습니다. 따라서 반응당 300개의 스파이크된 SARS-CoV-2 RNA 사본이 두 번째 단계에서 사용되었습니다. 이 단계에서 각 분석에 대해 LAMP 반응을 20회 반복했습니다. 분석 1과 3은 20개의 양성 반응 중 적어도 19개를 달성할 수 있었고, 분석 2와 4는 각각 18개와 16개의 양성 반응을 달성했습니다. FDA 지침에 따라 이러한 결과는 분석 1과 3의 LOD가 반응당 300개의 SARS-CoV-2 RNA 사본임을 입증한 반면, 분석 2와 4는 LOD를 설정하는 데 있어 FDA 지침을 충족하지 못했습니다.

 

LOD를 결정한 후 분석 1과 3에 대해 추가 검증(교차 반응성)을 수행했습니다. 아데노바이러스, 코로나바이러스 및 인플루엔자 바이러스에 이르는 식물상 및 기타 바이러스 병원체(보충 표 1 참조 ). 이 패널에는 패널의 모든 바이러스 병원체를 포함하는 2개의 대조군 세트(대조군 1 및 대조군 2)가 있습니다. 도에 도시한다. (2)C, 분석 1과 3 모두 RP2 대조군에는 반응하지 않았지만 SARS-CoV-2 양성 대조군에는 양성 반응만 보였다. 이는 두 분석 모두 SARS-CoV-2 RNA에 특이적임을 시사했습니다. 분석 1은 전통적으로 코로나바이러스의 표적이 되어온 N 유전자를 표적으로 하는데, 이는 20 , 21 , 22 , 23 에서 풍부하게 발현되기 때문입니다 . 따라서 더 큰 감도(100%)를 감안할 때 분석 1이 장치에 사용되도록 선택되었습니다.

 

샘플 수집 튜브

샘플 수집 튜브(그림 3 )는 DI 물로 부분적으로 채워진 원통형 튜브입니다. 튜브의 물리적 치수는 12.5mm(직경, D) × 52.3mm(길이, L)이며 RGD720 포토폴리머를 사용하여 적층 제조됩니다. 장치를 폐쇄 시스템으로 유지하면서 샘플을 수집하고 일회용 카트리지에 도입하도록 설계되었습니다. 이것은 튜브의 다른 끝에 있는 두 개의 나사 구멍으로 가능합니다. 샘플 또는 면봉은 수집 후 뚜껑으로 덮인 상단의 구멍을 통해 튜브에 넣습니다. 일회용 카트리지에 연결될 다른 구멍은 폴리아미드 접착 필름으로 밀봉됩니다. 이 필름은 연결 시 일회용 카트리지의 바늘로 구멍을 뚫어 수집된 샘플이 카트리지에 들어갈 수 있도록 합니다.

 

그림 3

그림3

샘플 수집 튜브의 디자인 도면 및 사진. 튜브의 다른 끝에 있는 두 개의 구멍, 한 쪽 끝은 샘플 입력용이고 다른 쪽 끝은 카트리지에 연결됩니다.

 

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메인 카트리지

주요 카트리지 구성 요소(그림 4 )는 73mm(길이, L) × 38mm(너비, W) × 10.9mm(높이, 높이) 직사각형 블록으로, 2mm 두께의 미세 유체 칩이 적층 구조 사이에 끼워져 있습니다. 제조된 제어판 및 베이스 플레이트.

 

그림 4

그림4

일회용 카트리지 디자인. ( A ) 카트리지 샘플 수집 튜브 어셈블리의 분해도. ( B ) 미세 유체 회로도는 ( C ) 칩의 단면도 와 관련된 미세 유체 칩의 사진과 겹칩니다 . ( D ) 조립된 메인 카트리지의 평면도.

 

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미세유체 칩

미세 유체 칩은 하나 개의 입구와 두 개의 출구, 그리고 챔버 (1)과 챔버 (2) (도. 시료 주입 관을 연결하는 마이크로 채널을 갖는 4 B, C)를. 3D 인쇄된 몰드를 사용하여 단일 소프트 리소그래피 단계로 PDMS(폴리디메틸실록산)로 제조되며 유리 슬라이드에 플라즈마 결합됩니다. 시료 채취 관 커넥트는 날카로운 선단이 위쪽 (도. 가리키는 조립 중공 바늘이있는 행의 입구, (4) A, D)를. 이렇게 하면 접촉 시 샘플 수집 튜브의 멤브레인 밀봉이 끊어집니다.

 

챔버 1과 2는 모두 압축 가능하며 챔버 사이에서 샘플을 이동시키는 프레스 펌프 역할을 합니다. 챔버 1(샘플 용해/RNA 추출)은 5.2mm(D) × 1.5mm(H)입니다. 시료 용해를 위해 연결된 시료 수집 튜브에서 시료를 채취합니다. 챔버 2의 크기는 5.2mm(D) × 0.6mm(H)이며 8µl의 LAMP 마스터 믹스가 미리 채워져 있습니다. LAMP 반응을 위해 챔버 1에서 약 5µl의 처리된 샘플을 가져옵니다. 챔버를 연결하는 것은 150 µm(W) × 100 µm(H) 크기의 마이크로 채널입니다. 채널을 통한 흐름은 컨트롤 플레이트의 토크 작동 밸브에 의해 제어됩니다.

 

컨트롤 플레이트

컨트롤 플레이트는 RGD720 포토폴리머로 추가 제조됩니다. 마이크로 채널의 개폐를 조작하기 위해 토크 작동 밸브 역할을 하는 4개의 너트와 볼트가 삽입됩니다. 이것은 흐름을 제어하기 위해 PDMS 칩의 상단 표면에 압력을 가하여 수행됩니다. 플레이트의 표면은 3개의 구멍으로 구성되어 있습니다. 하나는 샘플 수집 튜브를 장착하기 위해 칩 입구와 정렬되는 나사 구멍이고, 다른 하나는 챔버 1 및 2 상단에 있는 2개의 관찰 및 조작 구멍입니다.

 

토크 작동 밸브 및 프레스 펌프의 메커니즘

지난 10년 동안 미세유체 시스템에서 반복적인 시료 이동을 위한 수동 작동 액체 펌핑 시스템에 대한 관심이 높아졌습니다. 프레스 밸브( 24 , 25 , 26 , 27)를 사용하여 유체를 조작하는 수많은 우아한 디자인이 시연되었습니다 . 그러나 대부분의 이러한 장치에서 소프트 리소그래피, 사출 성형 프로세스 및 정렬 프로세스의 조합을 사용하여 제조 복잡성을 희생시키면서 작동 단순성이 보장되는 경우가 많습니다. 여기서 필요한 샘플 전송 단계의 제한된 수를 고려하여 " 재료 및 방법 " 섹션에 설명된 대로 단일 소프트 리소그래피 단계로 쉽게 생성할 수 있는 더 간단한 접근 방식을 사용합니다 .

 

우리의 설계에서는 칩에 있는 두 개의 압축 가능한 챔버와 제어판에 있는 토크 작동 밸브를 함께 사용하여 필요에 따라 소량의 샘플을 운반하고 혼합합니다. 메커니즘은 그림 5 에 설명되어 있습니다 . 입구와 다른 챔버 사이의 흐름은 토크 작동 밸브를 수동으로 조이고 풀어서 제어됩니다. 토크 작동 밸브를 조이면 PDMS 마이크로채널의 상단 표면에 하향 압력이 가해집니다. 이것은 채널을 무너뜨리고 흐름을 차단합니다. 밸브가 열리면 채널이 원래 모양으로 돌아갑니다. 채널은 다른 영역 (도. 유체 사이를 이동할 수 있도록 상기 칩의 상이한 영역을 연결하는 5 A).

 

그림 5

그림 5

펌핑 및 밸브 메커니즘. ( A ) 밸브 메커니즘의 개략도. ( B ) 압축된 챔버의 도면, 및 ( C ) 압축되지 않은 챔버의 도면 . ( D ) 챔버 1에서 진공을 생성하는 과정. ( E ) 챔버 1을 로딩하는 과정. ( E ) 챔버 2를 로딩하는 과정.

 

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유사하게, 유동 방향은 변형 가능한 챔버를 누르고 압력 차이를 국부적으로 조정하여 수정할 수 있습니다. . 45 kPa의 네가티브 압력 환경 (도 - 챔버 형상 챔버 천장에 단지 0.27 N (275 g) 부하를인가하는 것은 그 결과 45 %의 부피를 축소하도록 최적화 된 5 B는 C,도 S1이 보충 참조 자세한 내용은 정보). 아래에 자세히 설명되어 있고 비디오 S1에서 시연된 것처럼 이 음압은 7초 안에 최대 14μl의 샘플을 챔버로 빠르게 끌어들이기에 충분합니다.

 

채널의 입구에서 빠른 샘플 전송을 허용하기 위해 임시 진공 분위기가 챔버 (1) (도. 생성되는 5 D). 밸브 2가 열려 있고 다른 모든 밸브는 닫혀 있는 동안 챔버 1을 누르면 챔버 천장이 변형되고 챔버 1에 갇힌 공기가 배출구 1로 이동합니다. 밸브 2를 닫으면 챔버 1의 음압이 유지됩니다. 밸브 중 하나가 느슨해집니다.

 

작업 시작 시 카트리지에 시료 수집 튜브를 삽입한 후 사용자는 밸브 1을 엽니다. 이것은 챔버를 대기압에 연결하고 챔버의 음압을 운동 에너지로 변환하여 시료가 밸브 1로 흐르도록 합니다. 방. Valve1이어서 용균 단계 (도. 중에 챔버 (1) 샘플로부터 탈출을 방지하는 폐쇄 5 E).

 

처리된 샘플을 챔버 1에서 챔버 2로 옮기기 위해 사용자는 챔버 1과 챔버 2를 연결하는 밸브 3을 연 다음 챔버 2를 눌러 챔버 1로 5µl 기포를 옮깁니다. 이 작업은 챔버 2가 음압을 생성하도록 준비합니다. 챔버 1에 압력을 가합니다. 챔버 2 상단의 압력이 해제되면 두 챔버 사이의 압력 차이로 인해 용해된 샘플 5µl가 챔버 2로 유입됩니다. 그런 다음 밸브 3은 다음 단계 동안 챔버 2에서 샘플이 빠져나가는 것을 방지하기 위해 닫힙니다(그림 1). 5 F). SARS-CoV-2 RNA 스파이크 샘플이 있는 장치의 작동은 " 샘플 수집 튜브 " 섹션에 설명되어 있습니다.

 

재사용 가능한 제어 장치

제어 장치(그림 6 )의 크기는 9cm(L) × 6cm(W) ​​× 4cm(H)이며 외부 9V DC 0.5A 전원으로 전원이 공급됩니다. 제어 장치의 주요 기능은 일회용 카트리지의 온도를 제어하여 세포 용해(챔버 1) 및 LAMP 반응(챔버 2)이 일어나도록 하는 것입니다. 가열은 카트리지의 챔버 위치와 일치하는 두 개의 개별 세라믹 히터(1cm × 1cm)에 의해 제공됩니다. 프로그래밍 가능한 마이크로컨트롤러 기반 재사용 가능한 기본 장치는 기성품(OTS) 전자 부품과 3D 인쇄된 인클로저를 사용하여 개발되었습니다. OTS 구성 요소는 신속한 프로토타이핑 및 낮은 비용/전력 소비 요구 사항을 충족하기 위해 의도적으로 선택되었습니다.

 

그림 6

그림 6

휴대용 및 배터리로 작동되는 재사용 가능한 제어 장치. OTS(기성품) 전자 부품이 있는 마이크로컨트롤러 기반 재사용 가능한 기본 장치 개략도의 분해도.

 

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재사용 가능한 장치의 온도 프로파일과 제어는 챔버 1과 2에서 원하는 온도에 도달하도록 미세 조정되었습니다. 이를 위해서는 다음을 포함한 다양한 요인에 대한 정확한 추정 및 고려가 필요했습니다. 주어진 시간. (b) 기류를 통한 열 손실, 지지 구조(유리, PDMS, 3D 인쇄 부품)를 통한 전도 및 열 복사. (c) 재료의 상태, 가열될 재료의 치수 및 밀도, 비열, 원래 온도, 최종 온도 및 최종 온도에 도달하는 예상 시간과 같은 가열될 재료의 특성. (d) 온도 센서의 오프셋: 피드백 온도는 열전달 특성, 지연,

 

열 프로파일링 및 온도 제어는 FLIR i7 적외선 열화상 카메라로 수행한 후 제어 스케치 및/또는 디자인을 수정하여 그에 따라 미세하게 조정했습니다. 그림 7는 10초마다 측정된 지정된 챔버에 대한 온도 판독값의 그래픽 표현을 보여줍니다. 세라믹 히터가 더 높은 가열 속도를 가지며 히터에서 유리로의 열 전달이 온도 센서로의 열 전달보다 더 빠르다는 것이 처음에 발견되었습니다. 따라서 센서의 피드백 온도는 워밍업 단계에서 정확하지 않고 과열이 발생했습니다. 또한 표준 PID(Proportional-Integral-derivative) 제어 알고리즘의 구현은 선택한 온도 센서의 특성과 열 전달 특성으로 인해 신뢰할 수 없다는 것을 깨달았습니다. 오버슈팅을 완화하고 가열 프로세스를 제어하기 위해 프로그램 스케치에서 "설정점으로 램프(Ramp to Setpoint)" 알고리즘을 사용했습니다. "Ramp to Setpoint" 프로세스는 히터의 듀티 사이클 시간(on-off 시간)을 단축 및 조정하여 가열 프로세스 중 가열 속도를 제어합니다. 이와 관련하여 사이클 시간은 1초 미만으로 단축되었습니다. 도 1에 도시된 바와 같이. 도 7에 도시된 바와 같이, 튜닝 알고리즘의 구현은 오버슈팅 온도를 낮추고 오버슈팅 주기를 단축시켰다(20초 미만). 그 결과 각 챔버에 대해 잘 제어되고 균일한 열 프로파일이 생성되었습니다. 용해 과정 및 LAMP 반응의 열 프로파일링에 대한 비디오 녹화는 추가 정보(비디오 S2 , S3 ) 에서 찾을 수 있습니다 .

 

그림 7

그림 7

10초 간격의 온도 판독값 플롯. ( A ) 챔버 1 온도 프로파일은 5분 동안 유지된 2.5°C의 표준 편차(SD)와 함께 원하는 온도 95°C를 보여주었습니다. ( B ) 챔버 2 온도 프로파일은 30분 동안 0.9°C의 SD를 유지하면서 원하는 온도 60°C를 보여주었습니다.

 

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스파이크 SARS-CoV-2 샘플에서 실행: 단계별 절차

작동 단계의 세부 사항은 그림 8 과 비디오 S1에 나와 있습니다. 프로토타입 테스트의 목적으로 SARS-CoV-2 RNA의 300개 사본이 스파이크된 물을 사용했습니다. 사용 전에 분석 1의 LAMP 마스터 믹스 8μl를 주사기를 통해 배출구 2를 통해 챔버 2로 도입했습니다. 그런 다음 챔버 1을 미리 압축하고 모든 밸브를 닫힌 상태로 구성했습니다. 샘플 수집 튜브에는 용해 매질로서 1.5ml의 DI water가 미리 로드되어 있습니다.

 

그림 8

그림 8

장치의 단계별 작동 절차.

 

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1단계에서 SARS-CoV-2 RNA 스파이크 물 샘플을 샘플 수집 튜브에 추가했습니다. 뚜껑을 닫은 후 샘플이 탈이온수에 혼합되었는지 확인하기 위해 부드럽게 흔들었습니다. 그런 다음 샘플 수집 튜브를 스크류 인 메커니즘을 통해 일회용 카트리지에 연결했습니다. 이로 인해 일회용 카트리지의 온칩 바늘이 멤브레인 씰을 깨뜨려 샘플이 카트리지로 흘러 들어갈 수 있게 되었습니다.

 

2단계에서 카트리지는 스위치가 "켜짐" 위치로 설정된 재사용 가능한 제어 장치에 놓였습니다. 테스트 단계의 시작은 LED 색상을 빨간색으로 바꿔서 표시했습니다. 그런 다음 밸브 1은 닫힘 상태에서 열린 상태로 전환되어 챔버 1이 사전 진공 상태에서 원래 모양으로 돌아갔습니다. 이 작업은 샘플 수집 튜브에서 챔버 1로 소량의 샘플을 끌어들였습니다. 밸브 1은 역류를 방지하기 위해 닫혔습니다. 임상 샘플의 향후 테스트에서 앞서 설명한 바와 같이 열 용해를 통해 RNA를 추출하여 신속한 RNA 추출을 위한 효과적인 방법이 될 것으로 예상됩니다 17. 용해 과정은 촉각 스위치를 눌러 시작되어 챔버 1을 2분 이내에 95°C로 가열하고 온도는 다음 5분 동안 95°C ± 2.5°C에서 유지됩니다. 용해 과정이 끝나면 LAMP 시약의 온도 안정성 요구 사항(< 70°C)을 충족하기 위해 2.5분의 냉각 대기 시간이 도입되었습니다. 용해 프로세스 단계가 끝나면 LED 색상이 빨간색에서 녹색으로 바뀌고 부저가 울리기 시작합니다.

 

3단계에서 밸브 3을 열어 챔버 1에서 챔버 2로 용해된 샘플을 흘렸습니다. 챔버 2를 눌러 공기 방울을 챔버 1로 옮겼습니다. 해제 시 챔버 2를 원래 모양으로 되돌리고 5μl를 흡인했습니다. 용해된 샘플의 그런 다음 밸브 3을 닫았습니다. 챔버 2를 부드럽게 눌러 샘플을 핑크색을 띠는 미리 로드된 LAMP 마스터 믹스와 효과적으로 혼합했습니다. 두 번째로 촉각 스위치를 눌러 LAMP 반응을 시작했습니다. 60°C의 LAMP 원하는 온도는 1분 이내에 도달했으며 다음 30분 동안 60°C ± 0.9°C에서 유지되었습니다. 30분이 지나면 LED가 빨간색에서 녹색으로 바뀌고 부저가 계속 울리기 시작하여 LAMP 반응이 완료되었음을 나타냅니다.

 

결과는 챔버 2에서 직접 확인했습니다. LAMP 마스터 믹스 용액은 분홍색에서 노란색으로 바뀌었고 긍정적인 결과를 나타냅니다. 음성 테스트에서 색상은 분홍색으로 유지됩니다.

 

일반 참고 사항

개발된 장치는 RT-qPCR을 기반으로 하는 현재의 금본위제 COVID-19 NAAT를 보완할 가능성이 있습니다. 이 장치는 현장 진료에서 사용될 수 있으므로 과중한 중앙 집중식 실험실에 대한 압력을 완화하는 데 도움이 될 것입니다. 이는 임상 의사 결정을 가속화하여 시기적절한 치료 및 감염 통제 개입을 가능하게 합니다. 중요하게도, 이 장치는 원격 및 비의료 환경(예: 국경, 대규모 모임 장소)을 포함하여 전통적으로 사용이 불가능한 장소에 민감한 NAAT를 가져올 가능성을 열어줍니다. 이것은 사회가 "COVID-normal" 상태에서 기능하는 데 도움이 될 수 있습니다.

 

이 장치의 적응력이 높은 특성을 감안할 때 LAMP 분석에서 프라이머 세트를 간단히 수정하여 SARS-CoV-2의 향후 가능한 돌연변이를 감지할 수 있습니다. 또한 이 시스템을 기반으로 재사용 가능한 제어 장치를 유지하면서 다른 호흡기 병원체를 표적으로 하는 다양한 일회용 카트리지를 개발할 수 있습니다. 이 디자인은 장치를 COVID-19 진단을 넘어 매우 다재다능하게 만듭니다.

 

현재 프로토타입을 여러 가지 개선할 수 있습니다. 첫째, LAMP 마스터믹스에 파란색 기반 염료를 추가하거나 챔버 2에 필터를 적용하여 양성 및 음성 테스트 간의 색상 대비를 개선할 수 있습니다. 이러한 수정은 분홍색/노란색을 보라색/갈색으로 변환할 수 있습니다. 더 쉽게 시각화됩니다. 둘째, 여러 샘플을 동시에 테스트해야 하는 경우 제어 장치의 구성 요소를 마이크로컨트롤러 보드, 인쇄 회로 기판 및 히터로 대체하여 여러 카트리지의 가열 용량을 수용할 수 있습니다. 셋째, 테스트 절차는 현재 수동으로 작동되는 샘플 전송 단계를 수행하기 위해 장치에 전기기계식 액추에이터를 통합하여 자동화할 수 있습니다. 게다가,28 . 바이러스 수가 알려진 임상 샘플에 대한 향후 테스트는 이 장치의 보다 대표적인 LOD에 필수적입니다.

 

결론

우리는 활동성 COVID-19 감염 진단을 위한 울트라포터블, 자급식 POCT 프로토타입을 개발했습니다. 약 35분 만에 SARS-CoV-2를 감지할 수 있는 독립형 장치입니다. 이 장치는 다른 호흡기 병원체를 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 이 신속하고 소형화된 새로운 진단 플랫폼은 보다 시기적절한 감염 통제 개입을 가능하게 하는 잠재력을 가지고 있습니다.

 

재료 및 방법

램프 반응

LAMP 반응에는 1XWarmStart® Colorimetric LAMP Master Mix(New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), 0.2µM 정방향 및 역방향 프라이머(F3 및 B3), 1.6µM 내부 프라이머(FIP 및 BIP) 및 0.4µM 루프 프라임(LF 및 LB)이 포함되어 있습니다. . 사용된 모든 프라이머는 탈염 등급(Integrated DNA Technologies, Coralville, USA)이었습니다. 각 반응에서 5 μL의 템플릿 부피를 첨가하고 60℃에서 30분 동안 반응을 수행하였다. LOD 테스트를 위해 양성 RNA 대조군(Twist Bioscience, San Francisco, USA)을 5 μL당 100 RNA 사본 또는 300 RNA 사본으로 희석했습니다. 교차 반응성 테스트를 위해 각 NATtrolTM Respiratory Panel 2(RP2) Controls(ZeptoMetrix Corporation New York, USA) 5μL를 반응에 추가했습니다.

 

일회용 카트리지

후속 소프트 리소그래피 단계를 위한 높은 종횡비의 몰드(RGD 720 다목적 ​​투명 PolyJet 포토폴리머, Objet Eden260V PolyJet 3D 프린터)가 제어판과 함께 추가로 제조되었습니다. 미세 유체 칩을 생산하기 위해 10:1 PDMS-경화제 혼합물(Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트)을 진공 챔버에서 1시간 동안 탈기한 다음 금형에 붓고 70°C에서 8시간 동안 경화했습니다. 그런 다음 PDMS를 몰드에서 벗겨내고 메스 블레이드를 사용하여 원하는 크기로 다듬었습니다. 채널 입구 및 출구는 1.5mm 생검 펀치로 형성되었습니다. 조립 전에 PDMS의 표면은 플라즈마 클리너(PDC-32G-2, Harrick Plasma) 내부에서 21초 동안 0.6–0.8 torr 압력에서 18W 공기/산소 플라즈마에 노출되어 활성화되었습니다. 그런 다음 PDMS 채널을 유리 슬라이드에 공유 결합했습니다. 채널의 바닥을 둘러싸기 위해 플라즈마 활성화 직후에 접촉을 가져옵니다. 이것은 미세 유체 칩을 만듭니다. 그런 다음 8 μl의 마스터 믹스를 주사기(Becton Dickinson 0.5 ml 29G × 12.7 mm Medical Syringe)를 사용하여 미세 유체 칩에 로딩한 후 바늘, 제어 플레이트 및 패스너 등이 있는 칩을 메인 카트리지에 조립했습니다. 챔버 1은 배치 전에 챔버를 압축한 다음 모든 밸브를 닫아 사전 진공 상태였습니다.

 

아두이노 기반 재사용 유닛

ATmega328P 기반의 Arduino UNO REV3 마이크로컨트롤러 보드는 쉬운 프로토타이핑을 목적으로 사용되었습니다. 사각형 모양(1cm × 1cm), 마이크로 금속-세라믹 가열(MTH) 정제(R = 20Ω)를 챔버 1과 챔버 2의 바닥 아래에 두어 필요한 열 가열을 제공했습니다. 저전력 선형 능동 서미스터 IC(MCP9700A)를 아날로그 온도 센서로 사용하여 Arduino 아날로그 입력 핀과 인터페이스하여 실시간으로 온도를 읽습니다. 온도 센서의 피드백 온도와 미리 정의된 시간 간격은 히터를 켜고 끔으로써 챔버의 온도를 제어하고 유지하기 위해 Arduino 프로그램 스케치의 조건문에 사용되었습니다. 이와 관련하여 매우 낮은 온 저항(RDS(on) 0.016Ω @ VGS = 4)을 갖는 듀얼 n채널 MOSFET(Si4944DY). 5V) 및 빠른 스위칭 특성, 스위칭 회로에 사용되었습니다. Arduino 디지털 I/O 핀은 MOSFET 게이트 신호를 제어하여 스위칭 회로를 제어합니다. 마이크로 슬라이드 스위치(SPDT, 래칭) 및 촉각 스위치(SPST, 순간)는 Arduino 디지털 I/O 핀과 인터페이스되었으며 용해 단계 및 LAMP 단계의 시작을 트리거하는 사용자 인터페이스로 사용되었습니다. 2색(녹색 및 빨간색) LED 및 외부 압전 부저는 Arduino 디지털 I/O 핀과 인터페이스되었으며 테스트 단계의 끝을 나타내는 시각적 피드백 및 경보로 사용되었습니다. MOSFET(표면 실장 기술) 외에 저항, LED, 서미스터 IC 및 버저가 스루홀 부품으로 선택되었습니다. 따라서 인터페이스용으로 브레이크아웃 PCB ​​보드에 와이어를 납땜해야 했습니다. 2. SPST 로커 스위치가 있는 1mm DC 소켓이 전원 인렛 포인트로 장착되어 전원 은행, DC 플러그가 있는 배터리 홀더 및 표준 전원 어댑터와 함께 사용할 수 있습니다. Arduino 보드는 VIN 핀을 전원 입력과 인터페이스하여 동일한 전원으로 전원을 공급받았습니다. Arduino 보드의 조정된 5V 출력은 서미스터 IC의 전압 입력으로 사용되었습니다. 전자 회로도 및 OTS 구성 요소 목록은 추가 정보에서 찾을 수 있습니다(그림S2 및 표 S2 ). 재사용 가능한 기본 장치의 인클로저는 일회용 카트리지와 일치하고 세라믹 히터가 있는 지정된 챔버와 정렬되도록 설계되었습니다. RGD 720 수지는 Object Eden260V 3D 프린터에서 인클로저 부품의 3D 프린팅을 수행하는 데 사용되었습니다.

 

온도 프로파일링을 위해 FLIR i7 적외선 열화상 카메라(감도 ± 0.1 °C)를 히터의 일회용 더미 카트리지와 함께 사용하여 거동을 관찰했습니다. 지정된 챔버의 상단 PDMS 레이어는 챔버 내부의 온도를 정확하게 프로파일링하기 위해 천공되었습니다. FLIR i7 카메라를 고정하고 지정된 챔버에 초점을 맞춰 온도를 측정했습니다.

 

단순화된 전력 선택 분석이 수행되었으며 세라믹 가열 정제가 시스템의 주요 전력 요구 부분으로 식별되었습니다. 이와 관련하여 히터의 최종 온도 요구 사항과 주어진 짧은 시간에 발생하지 않고 챔버를 설정 온도에 도달시키는 데 필요한 전력을 고려하여 재사용 가능한 컨트롤러 설정을 위한 전원 요구 사항으로 9 V DC 0.5 A를 선택했습니다. 과열.