SARS-CoV-2 RBD의 S494 O-글리코실화 부위는 ACE2에 대한 바이러스 친화도와 감염력에 영향을 미칩니다. 분자 역학 연구

SARS-CoV-2 RBD의 S494 O-글리코실화 부위는 ACE2에 대한 바이러스 친화도와 감염력에 영향을 미칩니다. 분자 역학 연구

SARS-CoV-2는 COVID-19의 지속적인 대유행을 일으킨 코로나바이러스 계열의 변종입니다.

 

 

여러 연구에 따르면 숙주 세포의 바이러스 스파이크(S) 단백질과 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2) 수용체의 글리코실화가 바이러스 감염성에 중요합니다. 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 사용하여 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)에 대한 새로운 돌연변이 O-글리코실화 부위(D494S)의 역할을 조사했습니다. 이 사이트는 바이러스-호스트 상호작용의 핵심 매개체로 제안되었습니다. 3개의 O-글리코실화된 모델과 비글리코실화된 S4944 및 S494D 복합체의 제어 시스템의 역학을 조사함으로써, 연장된 O-글리칸으로 S494의 장식이 직접적인 RBD-ACE2에 대한 안정화된 상호작용을 초래하는 것으로 나타났습니다. RBD와 두 개의 주요 H1 사이의 거리 계산, ACE2의 H2 나선과 계면에서 상호작용하는 아미노산 쌍은 연장된 O-글리칸이 직접 결합 계면을 방해하지 않으면서 인접 잔기와 여러 극성 접촉을 형성함으로써 이러한 상호작용을 유지함을 보여주었다. RBD-ACE2의 상대적 결합 자유 에너지는 또한 더 긴 글리칸을 갖는 O-글리코실화된 모델에서 더 유리합니다. ACE2에 대한 RBD 결합 친화도의 증가는 부착된 O-글리칸의 크기에 따라 다릅니다. O-글리칸의 크기를 증가시키면 RBD-ACE2 결합 친화도가 증가합니다. 따라서 이 중요한 요소는 RBD-ACE2 상호작용에 대한 추가 억제 접근을 위해 고려되어야 합니다.

 

소개

중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 여전히 진행 중인 COVID-19의 대유행을 일으킨 양성감각 단일가닥 RNA 바이러스입니다. 2021년 3월 31일 기준 전 세계적으로 코로나19 확진자는 1억 2,800만 명, 사망자는 280만 명이다. 중국 우한에서 이 바이러스는 박쥐에서 인간으로 전파되는 것으로 믿어지고 1 종간 및 종 내 통과를 여러 번 거쳤습니다. 이 대규모 전염병은 여러 과학 그룹이 바이러스의 확산을 통제하고 감염된 환자를 모든 수단으로 치료하도록 동기를 부여했습니다. 연구자들은 주로 계통과의 원점에 집중되는 SARS-COV-2 (1) , 구조 및 조립 비리 숙주 세포 단백질의 역학 2 , 3 , 4 , 5 ,6 및 SARS-CoV-2 중화 항체를 얻기 위한 실험적 노력 7 , 8 .

 

SARS-CoV-2 비리온 어셈블리 및 인간 세포로의 주입은 SARS-CoV 2로 알려진 것과 유사합니다 . 스파이크(S) 단백질로 알려진 융합 단백질은 수용체 결합 도메인(RBD) 3 , 9 를 통해 숙주 세포의 ACE2와 상호작용합니다 (그림 1 ). RBD-ACE2 상호작용은 4개의 RBD의 가닥( β 4– β 7)과 ACE2 결합 계면(H1,H2) 3에 있는 두 개의 나선 (그림 1 ). 전자현미경과 X선 결정 구조를 통해 삼량체 2 로 조립되는 S 단백질의 활성 형태가 밝혀졌습니다.β\알파α, 그리고 ACE2 3 와 복합체를 이루는 S 단백질의 하나의 RBD . S 단백질의 구조 APO에와 ACE2는 단지이 RBD는 차원이 SARS-COV의 RBD 유사 배 채택 보여 바인딩 2 . 그러나 SARS-CoV-2 RBD에 대한 6개의 새로운 돌연변이는 ACE2 1 에 대해 서로 다른 결합 친화력을 유발할 수 있습니다 . SARS-CoV-2-ACE2 결합 친화도에 대한 추측은 두 가지 다른 시나리오를 제안했습니다. 하나는 SARS-COV에 비해 SARS-COV-2 ACE2에의 결합 친화력에 (배 20까지) 극적인 증가를보고 2 . 반면, 다른 하나는 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV에 대해 ACE2에 대한 유사한 결합 친화력을 제안합니다 3 , 10. 어느 쪽이든, SARS-CoV-2 RBD의 돌연변이는 확실히 SARS-CoV 2 에 성공적으로 작용하는 모든 설계된 억제제의 약화된 결합 친화력을 초래 합니다. 이는 대유행이 시작된 이후 항 SARS-CoV-2 약물 설계 시도에 있어 어려운 문제였습니다.

 

그림 1

그림1

SARS-CoV-2 S 단백질의 인간 ACE2 및 RBD의 세포외 도메인은 각각 회색 및 보라색으로 표시됩니다( A , B ). RBD 부착 O-글리칸은 녹색 구체( C )로 표시됩니다. 단순함을 위해 RBD-ACE2 인터페이스 부근의 N-글리칸만 분홍색 구체로 표시됩니다. N-글리칸이 완전히 표시되는 복합체의 시각화는 그림 S1 ( D ) 에서 찾을 수 있습니다 . 두 개의 O-글리칸 상호작용 부위 H1 및 H2는 주황색( E )으로 표시됩니다.

 

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RBD-ACE2 복합체의 3D 구조 외에도 최근 몇 가지 분자 역학(MD) 연구에서 펩타이드 억제제를 설계하기 위한 복잡한 역학을 다루었습니다. ACE2-RBD 상호 작용을 차단하고 추가 개선을 위해 현재 표적화된 결합 에피토프의 접근성을 평가합니다 4 , 11 , 12 . 이전 MD 연구 에서는 SARS-CoV-ACE2 복합체의 역학에 대한 pH 13 및 온도 14 의 영향을 조사했습니다. 우리가 아는 한, 현재 SARS-CoV-2에 대해 승인된 치료 억제제가 없습니다.

 

선구적인 연구에서는 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 및 S2 하위 도메인 접합부에서 관찰된 돌연변이가 SARS-CoV-2에 새로운 3개의 O-글리코실화 부위에 인접한 다염기 절단 부위의 출현을 초래한다는 것을 보여주었습니다. 다른 관련 virion 1 에서는 관찰되지 않았습니다 . O-글리코실화(효소적 포스트 초국가적 변형인 Ser/Thr 잔기의 하이드록실 산소에 글리칸 빌딩 블록의 추가 15 )는 푸린 효소에 의한 다염기 절단 부위의 인식을 유도할 수 있고, 따라서 더 높은 감염성 및 확장성을 초래할 수 있다고 제안 되었습니다. 바이러스의 숙주 범위 1 .

 

스파이크 단백질에 부착된 N-글리칸과 O-글리칸 모두에 대한 최근의 포괄적인 실험적 질량 분석 연구에서는 S494의 O-글리코실화를 보고하지 않았습니다. 그러나, 2개의 O-글리코실화된 부위(S325/T323)가 RBD 16 에 보고되었다 . 실험 데이터에 의해 검증된 또 다른 최근의 컴퓨터 연구에서는 Shajahan et al. 낮은 주파수 17 로 장식된 측면 다른 O-글리코실화 사이트를 따라 11%의 빈도로 존재 합니다.

 

SARS-CoV와 비교하여 SARS-CoV-2의 RBD에서 6개의 돌연변이가 보고되었습니다. 이러한 6가지 돌연변이 중 하나는 S 단백질의 RBD에 있는 D494S입니다. SARS-CoV-2 1 의 Furin 절단 부위의 O-글리코실화에 대해 제안된 메커니즘 과 위에서 언급한 실험적 구조 데이터에 기초하여 16 , 17 , O-글리칸으로 RBD의 Serine494 장식도 그럴듯합니다. 실험적으로 확인되지 않았습니다.

 

다른 모든 코로나바이러스와 그 가까운 친척의 외피 단백질의 병리 및 글리코실화 패턴에 대한 문헌에 대한 포괄적인 검토는 바이러스의 조절 및 면역 회피에서 O-글리코실화가 중요한 역할을 한다는 강력한 증거를 보여주었습니다 1 , 18 , 19 , 20 . 또한 이전 연구에서는 마우스 간염 바이러스(MHV)의 막(M) 단백질의 O-글리코실화가 N-글리코실화된 M 단백질보다 낮은 인터페론 수준을 유발한다는 것을 보여주었습니다 18. M 단백질의 부속 단백질인 MHV의 3A 단백질도 O-글리코실화된 것으로 알려져 있다. 따라서, 단백질에 부착된 대부분의 단당류를 절단하는 Peptide-N Glycosidase F(PNGase F)로부터 보호될 수 있습니다. 한편, O-글리코실화의 복잡한 비주형 기전은 여러 조직에 특이적인 폴리펩타이드 N-아세틸 갈락토오스아민 트랜스퍼라제(PPGalNAcT)를 통해 발생할 수 있으며, 이는 인플루엔자와 같은 여러 고회피 바이러스의 병리학에 대한 공통 기전인 것으로 나타났습니다. 21 . 사실, 실험 결과는 인간 호흡기도의 뮤신 단백질이 탄수화물 사슬로 심하게 O-글리코실화되어 있음을 시사합니다 22 , 23 , 24. 이러한 조밀한 O-글리칸 사슬은 다양한 박테리아 균주 25 와 같은 침입 미생물을 가두는 것으로 알려져 있습니다.

 

따라서 RBD-ACE2 복합체의 현재 이용 가능한 구조에서 O-글리코실화의 결여는 단백질의 발현 숙주 및 상이한 세포주에서의 다양한 글리코실화 패턴과 관련될 수 있다.

 

위에서 언급한 모든 정보를 종합하면 D494S 돌연변이가 진화적 기원을 갖고 SARS-CoV-2에서 RBD의 O-글리코실화로 이어진다는 것은 매우 그럴듯합니다. 따라서 O-글리코실화는 SARS-CoV-2가 ACE2에 대한 결합 친화도를 증가시킨 원인이 될 수 있으며, 이는 인간 숙주에서 바이러스의 높은 감염성을 설명하고 혈당 수치가 높은 사람을 더 높은 위험에 노출시킵니다 26 . 우리의 관찰은 당뇨병 환자가 감염에 더 취약한 이유를 설명할 수 있습니다.

 

여기에서, 우리는 O-글리코실화된 RBD 구조와 ACE2와의 상호작용에서 그 역학을 모델링함으로써 이러한 가능성을 탐구했습니다(그림 2 ). 우리는 O-글리코실화가 실제로 SARS-CoV-2 RBD-ACE2 결합 친화력을 증가시킨다는 것을 보여주었습니다. 그리고 연장된 O-글리칸의 부착은 결합 친화도를 증가시킬 것입니다. 또한 역학에서 S494의 구조적 역할을 완전히 제거하기 위해 SARS-CoV-2 RBD에서 S494가 D로 대체되는 구조적 역할을 고려하여 이러한 관찰의 유효성을 테스트했습니다.

 

요약하면, 이 연구는 호흡기도에서 SARS-CoV-2 RBD의 O-글리코실화가 비리온과 숙주 세포 수용체 사이의 더 강한 상호작용을 유도한다는 강력한 증거를 제공합니다.

 

따라서 추가 억제제 설계 시도는 여기에 보고된 상세한 원자 글리칸-단백질 상호작용을 향후 조사를 위한 중요한 요소로 고려해야 합니다.

 

행동 양식

RBD-ACE2 복합체의 모델 구축

ACE2의 세포외 도메인(잔기 19~615)(PDB ID: 6M0J)과 복합체를 이루는 SARS-CoV-2 RBD(잔기 333~526)의 결정 구조를 시작 구조로 사용했습니다. ACE2 구조를 안정화하는 데 중요한 역할을 하기 위해 결정 구조에서 분해된 Zn 2+ 및 Cl - 이온도 ACE2의 S1 및 S2 서브유닛에서 보존되었습니다. RBD(Asn343) 및 ACE2(Asn53, Asn90, Asn103, Asn322, Asn432 및 Asn546)의 N-글리코실화 모티프 내에 위치한 모든 아스파긴은 글리코실화되었습니다. GLYCAM 온라인 빌더 27 을 사용하여 올리고당 N-글리칸을 각 부위에 부착했습니다. 이 올리고당 모델은 정상 인간 세포 15 에서 발생하는 글리코실화의 기본 모델로 선택되었습니다 . 지원 테이블 S1 부착된 N-글리칸의 구조에 대한 세부 정보를 제공합니다.

 

RBD의 Serine494의 O-글리코실화는 GLYCAM 온라인 빌더 27을 사용하여 코어 및 분지형 전형적인 인간 O-글리칸의 3개 모델을 부착함으로써 수행되었습니다 . 모델 I, II 및 III은 각각 2, 5 및 6개의 단당류 단위로 구성됩니다(그림 2 ) . 모든 글리코시드 결합 및 결합 원자에 대한 자세한 내용은 그림 S.2 및 표 S.2 에서 확인할 수 있습니다. . 이러한 O-글리칸 모델은 RBD에 부착된 반면 RBD-ACE2 복합체는 완전히 N-글리코실화된 상태로 유지되었습니다(그림 1). O-글리칸이 부착되지 않은 RBD-ACE2 모델의 제어 시스템도 고려되었으며 모델 S로 지칭될 것입니다. RBD에서 Serine 494가 Aspartic acid로 치환된 모델은 RBD-ACE2 상호작용에서 SARS-CoV-2. 이 모델을 모델 D라고 합니다.

 

분자 역학 시뮬레이션

모든 시스템은 TIP3P 물 모델 28을 사용하여 용매화 되었고 150mM NaCl에서 완충 환경을 달성하여 중화되었습니다. 결과 물 상자는 대략 Å 의 차원을 가지며 일반적으로 각각 190000개의 원자로 구성됩니다. 모든 시스템은 CHARMM36m 포스 필드 29 , 30 및 NAMD2.12 31 로 매개변수화되었습니다.121 × 111 × 149삼시스템의 온도와 압력을 각각 310K 및 1bar로 유지하기 위해 Langevin 온도 조절 장치 및 Nose-Hoover Langevin 피스톤 방법을 사용하면서 모든 생산 실행은 NPT 앙상블에서 주기적인 경계 조건에서 수행되었습니다. . 단거리 비결합 반 데르 발스 상호작용의 계산을 위해 12 Å의 컷오프가 할당되었습니다. 입자 메쉬 Ewald 방법 32 는 장거리 정전기 상호 작용에 사용되었습니다. 모션 방정식의 통합을 위해 R-RESPA 다중 시간 단계 체계가 사용되었습니다 31. 이 적분기를 사용하여 Lennard-Jones 상호 작용과 결합된 상호 작용이 모든 단계 및 두 단계마다 정전기 상호 작용을 업데이트했습니다. SHAKE에 의한 모든 공유 수소 결합의 억제와 함께 통합을 위한 시간 단계는 2fs로 설정되었습니다. 모든 단지의 최종 모델은 입체적 충돌을 제거하기 위해 5000단계 동안 최소화되었습니다. 그런 다음 시스템은 NVT 앙상블에서 0.5ns 동안 평형을 이루고 NPT 앙상블에서 또 다른 0.5ns 이완이 뒤따랐습니다. 복합체(단백질, Zn +2 및 Cl -1 이온) 에서 원자의 위치는 스프링 상수 k = 1 kcal/(mol Å 인 조화 전위를 사용하여 제한되었습니다.2). 그런 다음 모델 S, I, II 및 III에 대해 100ns의 3회 복제로 생산 실행을 수행했습니다. 제어 모델 D의 경우 100ns의 두 가지 시뮬레이션이 수행되었습니다. (제어 모델 D에 대한 하나의 시뮬레이션 제외). 복합체의 PDB ID 6M0J 결정 구조를 선택하고 여러 최소화 단계와 광범위한 평형을 수행함으로써 ACE2 결합 RBD의 구조가 매우 잘 완화됩니다. 따라서 O-glycosylated RBD-ACE2의 Orientation은 신뢰할 수 있습니다.

 

생산이 진행되는 동안 단백질에 대한 모든 구속은 해제된 반면 Zn +2 및 Cl -1 이온 사이의 더미 결합 과 반경 3Å 내의 이들의 부속 원자는 손상되지 않은 상태로 유지되었습니다.

 

구속력 있는 자유 에너지 계산

RBD와 ACE2 사이의 결합 자유 에너지는 MMPBSA(Molecular Mechanics Poison Boltzmann Surface Area) 방법으로 계산되었습니다. 여기서 우리 는 MD 시뮬레이션의 마지막 10ns의 250개 프레임에 CaFE 파이프라인 도구 33 을 사용 하고 각 모델의 모든 복제에 대해 앙상블 평균을 사용했습니다. 정전기 에너지 계산을 위해 APBS 방법 34 가 사용되었습니다. 용매 및 단백질에 대한 유전 상수는 각각 80.0 및 1.2로 설정되었습니다(자세한 내용은 보충 방법에서 찾을 수 있음). SASA 계산을 위한 프로브 반경은 1.4Å로 설정되었습니다.

 

MD 시뮬레이션 분석

RMSD(Root Mean Squared Deviation), RMSF(Root Mean Squared Fluctuation), SASA(Solvent Accessible Surface Area) 및 RBD와 ACE2, H1 및 H2의 상호 작용하는 잔기 쌍 간의 거리는 VMD 35 를 활용하는 tcl 스크립트에 의해 계산되었습니다. . 각 시스템의 RMSD는 백본 원자(C , C 및 N) 를 고려하여 계산되었습니다 . RMSF와 도메인의 기하학적 중심 사이의 거리는 C 원자에 대해 계산되었습니다 . SASA는 RBD(405-505)와 ACE2(19-99) 사이의 계면 잔기를 선택하여 계산되었습니다. 모든 궤적은 시작 형태에 맞춰졌습니다. 모든 플롯은 Python 37 의 Matplotlib 36 라이브러리에 의해 생성되었고 수치는 VMD에 의해 생성되었습니다.αα35 .

 

그림 2

그림2

( A ) O-글리코실화된 RBD-ACE2 복합체의 중첩 표시가 빨간색 막대로 표시됩니다. SARS-CoV-2 S 단백질의 인간 ACE2 및 RBD의 세포외 도메인은 각각 회색 및 보라색으로 표시됩니다. 단순화를 위해 RBD-ACE2 인터페이스 부근의 N-글리칸만 녹색 막대로 표시됩니다. N-글리칸의 완전한 표현과 함께 복합체의 시각화는 그림 S1 에서 찾을 수 있습니다 . O-글리칸 모델 I( B ), II( C ) 및 III( D )는 원자 이름 막대와 함께 표시됩니다.

 

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결과 및 토론

O- 및 N- 글리코실화된 RBD-ACE2의 역학

여기서 모든 시스템이 완전히 N-글리코실화되기 때문에 N-글리칸의 전체적인 효과가 역학에서 명백하다는 점을 다시 언급할 가치가 있습니다. 그러나 결과의 해석은 주로 O-글리코실화에 초점을 맞추고 있습니다. 모든 시스템은 2번의 복제가 있는 대조군 모델 D를 제외하고 3번의 복제로 시뮬레이션됩니다. 각 RMSD 플롯에서 확률 분포 함수(PDF)는 이 텍스트에서 유연성으로 해석되는 RMSD 데이터의 변동을 보여줍니다. RMSD 플롯은 진화 역학 측면에서 복합체의 안정성을 나타내지 않으며 시뮬레이션의 제한된 시간 규모 내에서 RMSD의 변동만을 나타냅니다.

 

RBD-ACE2 복합 시뮬레이션의 RMSD 플롯은 세 가지 O-글리코실화된 시스템 중에서 모델 III( ), II( ) 및 S( ) 모델 I( )이 바로 뒤에 오는 동안 유사한 유연성을 보여줍니다 . (그림 3 A, B). 모델 D( )는 RMSD 값에서 극적으로 높은 변동을 보여줍니다(그림 3 ). 이 관찰은 D494S 돌연변이가 O-글리코실화와 상관없이 SARS-COV-2에서 RBD-ACE2 상호작용을 안정화시킨다는 것을 시사한다. RMSD 값에 대한 PDF의 히스토그램은 모델 I, S 및 D에 비해 모델 III, II의 피크 값에서 명확한 감소를 보여줍니다(그림 3 ).σ= 0.049σ= 0.051σ= 0.048σ= 0.138\시그마 = 0.203σ= 0.203

 

이 관찰은 길쭉한 글리칸 38 , 39 , 40 과 글리코실화에 따라 glubular 및 transmembrane 단백질 복합체의 증가된 안정성을 보고한 여러 다른 실험 및 계산 연구와 일치 합니다.

 

RBD의 전체 RMSF 값은 다른 모델이 다른 위치에서 RMSF의 높은 피크를 나타냄을 보여줍니다(그림 4 , 5 ). 그러나 직접 계면 잔류물 41에 대한 평균 RMSF의 계산은 모델 III 및 II에 대해 가장 낮은 값을 나타내었고 모델 S가 그 이후에 옵니다(표 1 ). 모델 D는 가장 높은 RMSF 값을 보여줍니다(표 1 ). 이는 모델 D를 가장 유연한 복합체로 나타낸 RMSD 결과를 뒷받침합니다. 변동의 가장 극적인 증가는 RBD의 모델 I 잔기 430에서 450에서 발생합니다(그림 4 ). 이 영역 내의 두 잔기(GLY446 및 Tyr449)는 ACE2와 직접 상호작용하는 것으로 알려져 있습니다 42. 2단위 O-글리칸을 모델 I에 부착하면 글리칸이 인접 잔기와 접촉을 형성할 만큼 충분히 길지 않기 때문에 이러한 상호작용이 불안정해집니다. 실험 결과가 호흡기도의 O-글리칸이 종종 길쭉한 올리고당인 것으로 나타났기 때문에 이러한 결과는 흥미롭습니다 25 .

 

그림 3

그림3

( A ) RBD-ACE2에 대한 평균 백본 RMSD 플롯은 각 시스템의 모든 복제에서 계산되며 모델 S(검정색), 모델 I(라임), 모델 II(주황색) 및 모델 III(파란색)에 대해 표시됩니다. 각 플롯 주변의 밝은 음영은 각 계산에 대한 표준 오차를 나타냅니다. 모델 D의 RMSD는 빨간색으로 표시됩니다. ( B ) 시뮬레이션의 마지막 40ns(점선)에 걸쳐 샘플링된 RMSD의 확률 밀도 함수(PDF)가 히스토그램으로 표시됩니다.

 

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그림 4

그림4

각 시스템의 모든 복제에서 계산된 RBD 잔류물당 RMSF는 모델 S(검정색), 모델 I(라임), 모델 II(주황색) 및 모델 III(파란색)에 대해 표시됩니다. 각 플롯 주변의 밝은 음영은 각 계산에 대한 표준 오차를 나타냅니다. 모델 D의 RMSF는 빨간색으로 표시됩니다.

 

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표 1 인터페이스 잔기의 평균 RMSF.

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그림 5

그림 5

( A ) 각 시스템의 모든 복제에서 계산된 ACE2 잔류물당 RMSF는 모델 S(검정색), 모델 I(라임), 모델 II(주황색) 및 모델 III(파란색)에 대해 표시됩니다. 각 플롯 주변의 밝은 음영은 각 계산에 대한 표준 오차를 나타냅니다. 모델 D의 RMSF는 빨간색으로 표시됩니다. 투명 상자는 H1 및 H2를 나타냅니다. ( B ) RMSF의 상대적 차이 는 모든 모델(동일한 색상 코드 사용)에 대해 잔류 표시됩니다.NSR M S F

 

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자세한 상호 작용

복잡한 하위 단위에 대한 자세한 조사는 RBD의 평균 RMSD 플롯이 모든 시스템에서 유사한 유연성을 나타내는 것으로 나타났습니다( , , 및 ) 가장 유연한 모델 D를 제외하고( )(그림 6 ). 그러나 부착된 O-글리칸이 ACE2 -Helices 와 상호 작용할 때 부착된 O-글리칸의 효과는 ACE2 RMSD 플롯에서 볼 수 있습니다 . ACE2 인터페이스에서 덜 유연한 역학으로 이어집니다(그림 7 A-C). 이 관찰은 또한 D494S 돌연변이가 RBD-ACE2 상호작용을 안정화시키는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다.σNS= 0.007σNSNS= 0.005σNSNSNS= 0.006σNS= 0.005σ= 0.015\alphaα

 

그림 6

그림 6

( A ) 각 시스템의 모든 복제에서 계산된 수용체 결합 RBD에 대한 평균 백본 RMSD 플롯은 모델 S(검정색), 모델 I(라임), 모델 II(주황색) 및 모델 III(파란색)에 대해 표시됩니다. 각 플롯 주변의 밝은 음영은 각 계산에 대한 표준 오차를 나타냅니다. 모델 D의 RMSD는 빨간색으로 표시됩니다. ( B ) 시뮬레이션의 마지막 40ns(점선)에 걸쳐 샘플링된 RMSD의 확률 밀도 함수(PDF)가 히스토그램으로 표시됩니다.

 

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그림 7

그림 7

( A ) 각 시스템의 모든 복제에서 계산된 ACE2에 대한 평균 백본 RMSD 플롯은 모델 S(검정색), 모델 I(라임), 모델 II(주황색) 및 모델 III(파란색)에 대해 표시됩니다. 각 플롯 주변의 밝은 음영은 각 계산에 대한 표준 오차를 나타냅니다. 모델 D의 RMSD는 빨간색으로 표시됩니다. ( A ') 시뮬레이션의 마지막 40ns(점선)에 걸쳐 샘플링된 RMSD의 확률 밀도 함수(PDF)가 히스토그램으로 표시됩니다. ( B ) 각 시스템의 모든 복제에서 계산된 -Helix1에 대한 평균 백본 RMSD 플롯은 모델 S(검정색), 모델 I(라임), 모델 II(주황색) 및 모델 III(파란색)에 대해 표시됩니다. . 각 플롯 주변의 밝은 음영은 각 계산에 대한 표준 오차를 나타냅니다. 모델 D의 RMSD는 빨간색으로 표시됩니다. ( 나α\알파') 시뮬레이션의 마지막 40ns(점선)에 걸쳐 샘플링된 RMSD의 확률 밀도 함수(PDF)가 히스토그램으로 표시됩니다. ( C ) 각 시스템의 모든 복제에서 계산된 -Helix2에 대한 평균 백본 RMSD 플롯은 모델 S(검정색), 모델 I(라임), 모델 II(주황색) 및 모델 III(파란색)에 대해 표시됩니다. . 각 플롯 주변의 밝은 음영은 각 계산에 대한 표준 오차를 나타냅니다. 모델 D의 RMSD는 빨간색으로 표시됩니다. ( C ') 시뮬레이션의 마지막 40ns(점선)에 걸쳐 샘플링된 RMSD의 확률 밀도 함수(PDF)가 히스토그램으로 표시됩니다.α

 

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ACE2 세포외 도메인은 약 600개의 아미노산을 가진 상당한 수용체입니다. 따라서,이 수용체의 전체 RMSD는 RBD (도. O의 글리코 실화에 의해 크게 변화하지 않을 것으로 예상된다 7 A). 우리는 ACE2-RBD 인터페이스의 변경을 연구하기 위해 ACE2 3 내에서 RBD 상호 작용 사이트로 알려진 두 개의 -Helices(그림 7 B,C) 의 RMSD를 계산했습니다 .α

 

H1 및 H2의 평균 RMSD 플롯은 O-글리코실화된 시스템이 이들 영역에서 상이한 유연성 거동을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 모델 I 및 III 덜 유연한 모델 II가이 영역에서보다 유연하다. ( 와 동안 ). 긴 당쇄와 모델 III은 상기가요 성 (도. 인 7 B). 모델 D에 대한 H1의 RMSD 플롯에서 두 개의 날카로운 피크 는 인터페이스에서 상당히 멀리 떨어져 있는 H1(그림 S3 ) 의 N 말단 세그먼트에서 매달린 잔기 19-22의 높은 변동으로 인한 것 입니다. 반면에 H2는 모델 I((σNSNSNS- 에이치2= 0.006 ) > (σNSNSNS- 에이치1= 0.004 )(σNS- 에이치2= 0.013 ) > (σNS- 에이치1= 0.006 )(σNSNS- 에이치2= 0.01 ) < (σNSNS- 에이치1= 0.02 )\sigma _{I-H2} =0.013 \sigma _{II-H2} =0.01 \sigma _{III -H2} =0.006 \sigma (\sigma _{S-H2} =0.01 ) \sigma _{III-H2} =0.006) (\sigma _{D-ACE2} =0.021 ), (\sigma _{D- H1} =0.061), (\sigma _{D-H2} =0.009)σNS- 에이치2= 0.013 ) 및 II ( ) 동안 모델 III ( )보다 지속적이고 (도. 도 7 C) 및 선물 다른 모델 중에서 가장 작은 값을가요. 모델 프로그램에게 유사한 동적 패턴 및 S 있지만 H1에 O 글리코 실화 모델 값을 여기에 명확한 유연성 감소 도시 비교 모델 III에 ( ). 모델 D는 전체 컴플렉스(그림 3 ) 및 RBD(그림 6 ) RMSD 플롯(σNSNS- 에이치2= 0.01σNSNSNS- 에이치2= 0.006σ(σNS- 에이치2= 0.01 )σNSNSNS- 에이치2= 0.006 )(σD - A C이자형2= 0.021 ) , (σD - H1= 0.061 ) , (σD - H2= 0.009 ) ).

 

ACE2하면 rmsf 플롯 이러한 관찰은이 모델을 보여주는 S (도.에 비해 글리코 실화 O 시뮬레이션 H2의 변동을 감소 지원 5 A). 차이점을 강조하기 위해도 모델 S에 비해 상대적 차이를 보여 주었다. 5 B. 상대적인 차이로 표현 여기서 는 각 모델의 잔기 RMSF당입니다. 정의에 따르면 더 많은 양의 는 더 낮은 상대 RMSF를 의미합니다.NSR M S F=R MNSNS0- R MNSNSNSR MNSNS0+ R MNSNSNSR MNSNSNSNSR M S F

 

역학의 시각화는 O-글리칸이 H2(H2의 5개 사이트(N61,K68,A71,F72,E75)와 H1(N38, L39, N49)의 3개 사이트)와 가장 많은 극성 접촉을 형성함을 보여줍니다. 그림 8 . ) 대조적으로, 결정 구조에 따라 H1은 H2 3 보다 RBD와 더 많은 접촉을 형성한다 . 부착된 O-글리칸의 RMSD 플롯은 또한 연장된 모델 II 및 III이 더 유연함을 보여줍니다. 그림 S2 . 그것은 H2와 형성되는 몇 가지 극성 상호 작용 때문입니다. RBD는 X선 결정 구조에서 O-글리코실화되지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 사실 시뮬레이션에서 O-글리칸과 H2 사이의 더 많은 상호작용을 볼 수 있다는 사실은 O-글리칸이 H1에서 발생하는 주요 리간드-수용체 상호작용을 방해하지 않음으로써 RBD-ACE2를 함께 유지한다는 것을 시사합니다.

 

그림 8

그림 8

SARS-CoV-2 S 단백질의 인간 ACE2 및 RBD의 세포외 도메인은 각각 회색 및 보라색으로 표시됩니다. RBD가 부착된 O-글리칸은 원자 이름 막대로 표시됩니다. RBD-ACE2 인터페이스 부근의 N-글리칸은 주황색 구체로 표시됩니다. ACE2의 H1과 H2와 부착된 O-글리칸 사이의 지속적인 극성 상호작용은 AC로 표시됩니다.

 

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ACE2에 대한 O-글리코실화된 RBD의 결합 친화도

O-글리코실화된 모델 II 및 III의 감소된 변동이 반드시 더 강력한 RBD-ACE2 상호작용을 증명하는 것은 아닙니다. 그러나 RBD-ACE2, RBD-H1, RBD-H2와 인터페이스에서 상호 작용하는 모든 쌍 사이의 거리를 계산하면 이 메커니즘에 대한 힌트를 얻을 수 있습니다. RBD-ACE2 거리 값 프로그램 배포 모델 III 및 S 시뮬레이션 (도.의 (49 Å의 피크)과 유사한 패턴 9 A). 모델 II에서, I 및 D 시뮬레이션 및 RBD ACE2 각각 1, 1.5 2A 먼 (도. 의해 있지만 9 A). 모델 D에서 RBD와 ACE2 사이의 거리 변동이 더 많이 변경됩니다. ACE2-RBD 외에도 ACE2의 RBD, H1 및 H2 사이의 거리도 측정되었습니다(그림 9기원전). 플롯은 RBD 두 나선 (도. 간의 감소 리드 항상 그런 O 글리코 실화 표시 9 B, C). 모든 O 글리코 실화 모델은 모델 S (도. 비교를 위해 감소는 H1-RBD 거리 더 중요 9 B). 반면, H2-RBD 거리 분포는 또한 O-글리코실화된 모델의 감소를 나타냅니다. 모델 D는 H1-RBD 및 H2-RBD 플롯 모두에서 가장 큰 거리 값을 보여줍니다(그림 9 B, C). 이러한 관찰은 RBD-ACE2 결합이 연장된 올리고당과 S494의 O-글리코실화 시 직접적인 계면에서 더 강해야 함을 시사한다. 모델 I가 가장 결합 인터페이스에 노출된다는 RBD-ACE2 인터페이스 표시 (도.위한 조릿대 플롯 9 D 및 9 내지 약 1000 Å의 증가와 함께 E)이자형2 다른 모델에 비해. 이는 인터페이스의 유연성을 증가시켜 모델 I의 인접 잔기와 약한 상호 작용을 형성하는 작은 2단위 글리칸으로 인해 모델 I에서 불안정한 상호 작용을 나타낸 거리 분포 및 RMSD/RMSF 플롯을 지원합니다.

 

RBD-ACE2 계면에서 상호작용하는 모든 잔기 쌍의 거리 분포 플롯도 계산하였다(도 10 ). 플롯의 전반적인 경향은 모델 S, III 및 II에서 매우 유사합니다. 인터페이스의 주요 상호 작용이 O-글리칸에 의해 변경되거나 강화되지 않음을 보여줍니다. 이것은 더 강한 RBD-ACE2 상호작용을 유도하는 글리칸과 이웃 잔기 사이의 극성 접촉 때문입니다(그림 8 ). 가장 변동이 심한 거리 분포는 모델 D에서 발생합니다. 여기서 상호 작용하는 쌍 15개 중 7개(ACE38-RBD498, ACE353-RBD496, ACE34-RBD417, ACE34-RBD453, ACE37-RBD505, ACE42-RBD446, ​​ACE42-RBD446, ​​ACE3023)가 있습니다. 다른 시스템에 비해 피크 위치가 눈에 띄게 증가했습니다(그림 10). 대부분의 상호작용 쌍에서, 긴 올리고당을 갖는 O-글리코실화된 모델은 가장 작은 피크 값을 나타낸다(도 10 ). 2개의 상호작용 쌍(ACE353-RBD498, ACE31-RBD493 및 ACE355-RBD500)에서 모델 D는 분포 피크의 감소를 보여줍니다(도 10 ). 서로 다른 상호 작용 쌍에 대한 모델 D 플롯의 눈에 띄는 증가 및 감소는 시스템의 유연성과 약화된 RBD-ACE2 상호 작용을 보여줍니다. O-글리코실화된 모델 중에서 I는 ACE38-RBD449 및 ACE42-RBD446 상호 작용 쌍에 대해 증가된 피크 값을 나타내는 유일한 시스템입니다. 모델 I은 가장 유연한 O-글리코실화된 모델인 것으로 나타났습니다(그림 3). 모델 II 및 III 시뮬레이션에서 발생하는 방식으로 계면에서 인접 잔류물과 접촉을 형성할 수 없는 짧은 2단위 글리칸에 의해 시스템에 추가되는 유연성으로 인해(그림 8 ).

 

그림 9

그림 9

( A ) 히스토그램 및 최대 가능성 가우스 분포 적합이 있는 RBD 대 ACE2 평균 거리 분포의 PDF: 각 시스템의 모든 복제에서 계산되고 모델 S 및 I–III에 대해 각각 검정, 석회, 주황색 및 파랑으로 표시됩니다. 모델 D의 PDF는 빨간색으로 표시됩니다. ( B ) 히스토그램 및 최대 가능성 가우스 분포 적합이 있는 H1 평균 거리 분포에 대한 RBD의 PDF: 각 시스템의 모든 시뮬레이션에서 계산되고 모델 S 및 I–III에 대해 각각 검정, 석회, 주황색 및 파랑으로 표시됩니다. 모델 D의 PDF는 빨간색으로 표시됩니다. ( C) 히스토그램 및 최대 가능성 가우스 분포 적합이 있는 RBD에서 H2까지의 평균 거리 분포의 PDF: 각 시스템의 모든 시뮬레이션에서 계산되고 모델 S 및 I–III에 대해 각각 검정, 석회, 주황색 및 파랑으로 표시됩니다. 모델 D의 PDF는 빨간색으로 표시됩니다. 샘플링은 시뮬레이션의 마지막 40ns에서 수행되었습니다. ( D ) RBD-ACE2 인터페이스의 SASA 플롯은 각 시스템의 모든 시뮬레이션에서 계산되고 모델 S 및 I–III에 대해 각각 검정, 석회, 주황색 및 파랑으로 표시됩니다. 모델 D의 SASA 플롯은 빨간색으로 표시됩니다.

 

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그림 10

그림10

RBD-ACE2 인터페이스 상호 작용 쌍의 PDF는 히스토그램 및 최대 가능성 가우스 분포 적합이 있는 평균 거리 분포: 각 시스템의 모든 복제에서 계산되며 모델 S 및 I–III에 대해 각각 검정, 석회, 주황색 및 파란색으로 표시됩니다. 모델 D의 PDF는 빨간색으로 표시됩니다.

 

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RBD와 ACE2 사이의 결합 자유 에너지는 또한 더 긴 부착된 글리칸을 갖는 모델 II 및 III에서 O-글리코실화 시 상호작용이 가장 유리함을 보여줍니다(도 11 ). MMPBSA 방법으로 계산 RBD-ACE2 사이의 결합 자유 에너지는에 단조 감소 표시 O 글리 칸의 크기 (.도 증가하여 G를 11 17 ± 0.66 킬로 칼로리 / 몰 -)으로부터 쳐다 모델 I의 경우 - 32±4.69 kcal/mol, 모델 II 및 III의 경우 각각 -37.00±3.92 kcal/mol입니다(그림 11 ). 대조군 모델 S와 D는 덜 유리한 결합 에너지를 나타냅니다. 모델 D는 가장 작은 보여줍니다.△\델타△G 값 - 모든 시스템 중 10.00±5.193 kcal/mol. 이는 SARS-COV-2의 RBD에서 S494의 출현이 비리온-ACE2 상호작용을 촉진하는 것을 보여주는 S494D 치환 시 복합체의 극적인 불안정성 때문입니다. 흥미롭게도, 코어 O-글리칸이 있는 모델 I에서 결합 자유 에너지는 모델 S(-18±7.439kcal/mol)에 비해 덜 유리합니다(-17±0.66kcal/mol).

 

이는 ACE2-RBD 결합 계면에서 유연성이 증가하고 길이가 작아 코어 글리칸이 만드는 극성 상호작용이 감소하기 때문입니다. RBD 및 전체 ACE2-RBD의 RMSD 및 RMSF 플롯(그림 3 , 4 및 6 )은 이러한 관찰을 뒷받침하며 모델 I에 대한 복합체의 유연성 증가를 보여줍니다. 용질 유전 상수의 선택된 값은 다음을 갖는 것으로 나타났습니다. MMPBSA 방법을 사용하는 동안 결합 ​​자유 에너지 예측에 대한 극적인 효과 43 , 44 , 45 , 46(지원 정보의 방법 섹션 참조). 유전 상수에 대한 주어진 값에 관계없이, 더 긴 글리칸을 갖는 O-글리코실화된 모델 II 및 III에서 결합 자유 에너지의 감소는 항상 지속되고 통계적으로 유의하다(도 11 ). 글리코실화된 단백질-리간드 복합체에서 결합 자유 에너지의 증가는 다른 연구 39 , 47 에서도 보고되었습니다 .

 

긴 O-글리칸이 부착된 ACE2와 RBD 사이의 안정화된 역학과 더 유리한 결합 에너지는 SARS-CoV-2의 흡수와 높은 회피 가능성을 증가시킬 수 있습니다. 그러나 결합 인터페이스의 각 잔기에 대한 글리코실화 효과를 테스트하기 위해 실험과 병행하여 추가 시뮬레이션을 수행하는 것은 여기에 보고된 관찰의 유용한 검증이 될 수 있습니다.

 

그림 11

그림11

RBD-ACE2 복합체에 대한 상대적 결합 자유 에너지 성분. 모델 D, S, I–III의 전체 결합 자유 에너지는 빨간색, 검은색, 석회, 주황색 및 파란색으로 표시됩니다.

 

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결론

SARS-CoV-2에서만 발생하고 SARS-CoV에서는 발생하지 않는 S494는 직접 RBD-ACE2 결합 계면에 위치하여 O-글리칸에 의해 장식될 가능성이 있습니다. 이전의 실험 및 컴퓨터 연구에서는 SARS-CoV-2 높은 감염성에서 O-글리코실화의 역할을 강조했습니다. ACE2와 복합된 SARS-CoV-2 RBD의 원자 분자 역학 시뮬레이션 결과는 S494의 O-글리코실화가 RBD-ACE2 간의 더 강한 상호작용을 유도하여 바이러스 감염성을 증가시킬 수 있음을 시사합니다. RBD에 부착된 세 가지 모델의 코어 및 연장된 O-글리칸이 테스트되었으며 결과는 여기에서 비글루코실화된 S494 및 S494D 시스템과 비교되었습니다. 우리는 길쭉한 O-글리칸의 부착이 덜 유연한 ACE2-RBD 역학을 유도하고 RBD와 두 개의 주요 H1 사이의 거리를 감소시키는 것을 관찰했습니다. 직접 결합 계면에서 상호 작용하는 아미노산 쌍을 유지하는 ACE2의 H2 나선. RBD-ACE2의 상대적 결합 자유 에너지는 또한 더 긴 글리칸을 갖는 O-글리코실화된 모델에서 더 유리합니다. ACE2에 대한 RBD 결합 친화도의 증가는 부착된 O-글리칸의 크기에 따라 다릅니다. O-글리칸의 크기를 증가시키면 RBD-ACE2 결합 친화도가 증가합니다. 이러한 관찰은 SARS-COV에서 발생하는 글리코실화되지 않은 S494의 원자 시뮬레이션과 S494의 D로의 치환에 의해 확인되었습니다. 이 두 시스템은 결합 경계면에서 약화된 상호작용과 ACE2에 대한 덜 유리한 결합 친화성으로 더 유연합니다. ACE2에 대한 RBD 결합 친화도의 증가는 부착된 O-글리칸의 크기에 따라 다릅니다. O-글리칸의 크기를 증가시키면 RBD-ACE2 결합 친화도가 증가합니다. 이러한 관찰은 SARS-COV에서 발생하는 글리코실화되지 않은 S494의 원자 시뮬레이션과 S494의 D로의 치환에 의해 확인되었습니다. 이 두 시스템은 결합 경계면에서 약화된 상호작용과 ACE2에 대한 덜 유리한 결합 친화성으로 더 유연합니다. ACE2에 대한 RBD 결합 친화도의 증가는 부착된 O-글리칸의 크기에 따라 다릅니다. O-글리칸의 크기를 증가시키면 RBD-ACE2 결합 친화도가 증가합니다. 이러한 관찰은 SARS-COV에서 발생하는 글리코실화되지 않은 S494의 원자 시뮬레이션과 S494의 D로의 치환에 의해 확인되었습니다. 이 두 시스템은 결합 경계면에서 약화된 상호작용과 ACE2에 대한 덜 유리한 결합 친화성으로 더 유연합니다.

 

이 연구의 결과는 SARS-CoV-2-ACE2 글리코실화의 현재 상태와 바이러스의 높은 회피율에서의 역할에 대한 통찰력 있는 정보를 추가합니다. 이 가설은 실험적 검증에 적합한 대상이며, 중요하다고 입증되면 추가 치료 설계에서 고려해야 합니다.